Вы здесь

Одержання екстракту з кріоконсервованих фрагментів ксеноселезінки та його застосування при абсцесах легенів

Автор: 
Бизов Володимир Вікторович
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2002
Артикул:
0402U002111
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Получение фрагментов селезёнки свиньи, подготовка к замораживанию, замораживание, отогрев и приготовление из них экстракта
Селезенку получали на Харьковском мясокомбинате и доставляли в лабораторию на льду. Затем её иссекали на фрагменты весом 5 - 10 мг и три раза отмывали в 10-кратном объеме физиологического раствора. В качестве криопротекторов использовали ДМСО и ПЭО-1500 в конечных концентрациях 10 и 20 процентов. Растворы криопротекторов, содержащих их двойную концентрацию, добавлялись капельно к фрагментам ткани в соотношении 1:1. Все манипуляции производились при +4?С. Замораживание проводили со скоростью 1?С/мин с помощью программного замораживателя УОП-6 в пластиковых ампулах объёмом 1мл до -70?С с последующим погружением в жидкий азот. Образцы отогревали на водяной бане при +40?С. Отмывку от ДМСО проводили сахарозными средами той же молярной концентрации, что и криопротектор с последующей их заменой на физиологический раствор. ПЭО-1500 отмывали в 10-кратном объёме физиологического раствора. Экстракт получали инкубируя фрагменты селезёнки в физиологическом растворе (рН - 7,4), в соотношении 1:10, при 20-23?С, затем центрифугировали в течение 15 мин при 1500 об/мин и надосадок процеживали через фильтр одноразовой системы для переливания крови. При получении экстракта для клинического применения все манипуляции производили с соблюдением правил асептики. Исходный материал и полученные образцы экстракта исследовали на отсутствие контаминации микрофлорой по стандартным методам [24,84].
Экстракт, предназначенный для клинического применения, расфасовывали в стеклянные флаконы по 5 мл и закрывали резиновыми пробками с фиксацией парафилмом. Хранение экстракта проводили в морозильной камере бытового холодильника при -6?С.
2.2. Определение характера перекисных процессов в ткани
Для определения ТБКАП в ткани, фрагменты селезёнки гомогенизировали в 100 ммоль трис НСl буфере (рН 7,4) и фильтровали через нейлоновую ткань. Соотношение навески ткани и объёма среды гомогенизации составляло 1:20. К 2,5 мл гомогената добавляли 1мл 30% трихлоруксусной кислоты и центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. К 2мл надосадочной жидкости добавляли 1мл 0,75% раствора ТБК и 0,1 мл 5 молярной НСl. Пробы помещали на 10 мин в кипящую водяную баню. После охлаждения проб измеряли их оптическую плотность при длине волны 532 нм против контроля, которым являлся буферный раствор. Молярный коэффициент экстинции ТБКАП принимали равным 1,56 х 105 см-1 х моль-1.
Для хемилюминесцентного определения характера перекисных процессов ткань селезенки мягко гомогенизировали и отстаивали 10 мин. В ячейку хемилюминометра, содержащую 1 мл физиологического раствора, добавляли 100 мкл густой суспензии гомогената и 10-2 моль двухвалентного железа в конечной концентрации. Регистрировали интенсивность свечения в течение 1 мин, результат выражали в относительных единицах или представляли как нормированное значение, т.е. отношение полученного значения к контролю. Известно, что интенсивность хемилюминесценции пропорциональна количеству свободных радикалов, а следовательно и интенсивности перекисных процессов. Измерения проводили через 15 мин после отогрева материала.
Для определения устойчивости ткани к перекисному окислению в ячейку хемилюминометра, содержащую 1 мл физиологического раствора и 100 мкл гомогената ткани, добавляли 200 мкл 5% раствора перекиси водорода и в течение 1 мин регистрировали интенсивность свечения. Результат выражали в относительных единицах или представляли в виде нормированного значения, т. е. отношение полученных значений к контролю. Измерения проводили через 15 мин после отогрева материала.

2.3. Получение спленоцитов и определение сохранности фрагментов ткани и спленоцитов по интенсивности дыхания и окрашиванием трипановым синим.
Спленоциты получали путём щадящего диспергирования фрагментов в охлаждённом до +4?С Рингер-фосфатном буфере, рН 7,4. Суспензию фильтровали. Клетки осаждали центрифугированием при 250 g на протяжении 10мин и ресуспендировали в том же самом буфере. Количество изолированных клеток подсчитывали в камере Горяева. Их сохранность определяли путём окрашивания трипановым синим. Для этого клетки инкубировали с 0,3% раствором красителя в течение 5 мин при комнатной температуре, затем подсчитывали долю повреждённых клеток, которые имели ярко выраженную окраску ядра, либо ядра и цитоплазмы.
Интенсивность дыхания фрагментов селезенки и спленоцитов определялась на полярографе фирмы Radelkis. Динамика эндогенного дыхания регистрировалась на самописце и рассчитывалась в нмоль О2/мин/мг ткани или нмоль О2/108 клеток.

2.4. Определение состава экстрактов из криоконсервированных фрагментов ксеноселезёнки
Общую концентрацию белков в экстракте определяли с помощью модифицированного метода Лоури с помощью реактива Фолина - Чикольте. [206]. Чувствительность метода составляет 0,2 мкг белка.
Концентрацию полипептидов и нуклеотидов определяли спектрофотометрическим методом при длинах волн 280 нм и 260 нм соответственно по калибровочным кривым. Белки из экстракта предварительно осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 3000 об/мин после его кипячения на водяной бане в течение 15 мин [86].
В экстракте, предназначенном для клинического применения, изучали молекулярно-массовое распределение фракций. Для этого использовали метод высокоэффективной гельпроникающей хроматографии - ВЭГПХ [230,233].
Для определения молекулярных масс пептидных фракций использовали несколько стандартных веществ: фенилаланин с мол. м. 165, инсулин с мол. м. 5600, димер инсулина с мол. м. 11000 и бычий сывороточный альбумин (БСА) с мол. м. 65000.
Анализ осуществляли на приборе фирмы Waters, модель Allians, с диодно-матричным детектором. Условия анализа: колонка TSK SW 2000 7 мм*600 мм. Подвижная фаза: буферный раствор карбоната аммония ( рН 7.0) - ацетонитрил ( 70:30). Скорость подвижной фазы