Вы здесь

Особливості будови тимусу новонароджених (анатомо-експерименнтальне дослідження).

Автор: 
Григор\'єва Олена Анатоліївна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2002
Артикул:
0402U002367
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами исследования послужили 27 тимусов человека (новорожденных, умерших в течение первой недели после рождения). На первом этапе работы изучали морфологию тимуса человека в перинатальном периоде. Однако из-за сложности стандартизации набранного материала (всем умершим была оказана медицинская помощь, забор органов производили через 2-4 часа после смерти) на втором этапе работы было произведено исследование клеточной динамики тимуса белых крыс в раннем постнатальном периоде.
Изучено 173 тимуса белых крыс линии Вистар от момента рождения до 7-х суток постнатальной жизни. Крыс содержали в соответствии с рекомендациями И.П.Западнюк и др. (1983) [62]. Новорожденных получали от крыс с датированным сроком беременности, установленным методом влагалищного мазка. Новорожденные крысята рождались доношенными, в срок, на 23-24 день после зачатия в различное время суток. Все беременные самки до достижения четырнадцатидневного срока после зачатия содержались в условиях вивария по 5 особей в клетке. Затем беременных самок, отобранных для наблюдения, содержали в отдельных клетках в тех же условиях. С целью более полного описания особенностей морфологии тимуса в самом напряженном раннем постнатальном периоде онтогенеза забой новорожденных животных осуществляли с интервалом в 2 часа начиная от момента рождения в течение первых 12 часов жизни, в дальнейшем с интервалом в 4 часа до 48 часа после рождения, с интервалом в 6 часов на протяжении третьих суток жизни, и с интервалом в 12 часов до конца первой недели после рождения.
Распределение тимусов человека и лабораторных животных по срокам наблюдения представлено в таблицах 2.1. и 2.2. Забор тимусов крыс осуществляли сразу после забоя, быстро, минимально касаясь органов,
чтобы избежать артефактов в паренхиме. На нефиксированном материале изучали форму, массу и объем вилочковой железы крыс. Тимус взвешивали на торзионных весах ВТ-500 с предельной нагрузкой 500 мг и точностью ± 5 мг, вычисляли его относительную массу в процентах к массе животного, объем органа определяли по методике G.Bloom, U.Fiberg (1956), вычисляли удельную плотность вилочковой железы.
Для гистологического и гистохимического исследований тимус крыс фиксировали в жидкости Буэна, тимус человека - в нейтральном формалине. Кусочки обезвоживали в восходящей батарее спиртов, начиная с 50%. В качестве промежуточной среды применяли хлороформ. Кусочки заливали в смесь парафина, воска и каучука (20:1:1). В блоке тимуса ориентировали апикальной поверхностью к плоскости микротомного ножа, из блока изготавливали 150-200 серийных срезов толщиной 5-6 мкм. Для гистологического и гистохимического исследований тимус крыс фиксировали в жидкости Буэна, тимус человека - в нейтральном формалине. Кусочки обезвоживали в восходящей батарее спиртов, начиная с 50%.. Рецепты приготовления растворов взяты из руководств R.Lillie (1974) [225], Пирс (1962) [252], Авцын А.П., Струков А.И., Фукс Б.Б. (1971) [2].
Методы исследования, использованные в работе, приведены таблице 2.3.
В срезах тимуса при увеличении микроскопа (об. 40, ок. 7) изучали относительную площадь, занимаемую субкапсулярной зоной, корковым и мозговым веществом. При иммерсионном увеличении микроскопа (об.
Таблица 2.2.
Распределение тимусов лабораторных животных по срокам наблюдения
Сутки жизни1-е2-е3-и4-е5-е6-е7-еЧасы после рождения0246812162024283236404448546066728496108120132144156168Количество животных768666666677676656766667655Всего:167
Таблица 2.3
Методы исследования, использованные для изучения морфофункционального состояния тимуса новорожденных
№ п?пМетоды исследования1Обзорная микроскопияШИК-реакция, с докраской ядер гематоксилином2Морфометрическое изучение морфо-функциональных зон, кле-ток тимуса
Морфометрия, количественный, визуальный учет3Выявление сосудов микроцирку-ляторного руслаИмпрегнация нитратом серебра по Лейдлоу4Гистохимическое определение гликопротеидов при помощи ШИК-реакцииПрямая реакцияПосле обработки срезов диастазойКислотный гидролиз5Гистохимическое определение гликозаминогликанов при помощи альцианового синегоПосле предварительной обра-ботки срезов тестикулярной гиалуронидазойС критической концентрацией МgСl2 0,2М, 0,6М, 1М6Гистохимическое определение рецепторов к лектину чечевицы (LCА)Прямая реакция с коньюгатом LCA-НRРИнкубация с коньюгатом LCA-НRР в присутствии лактозы7Гистохимическое определение рецепторов к лектину завязей пшеницы (WGА)Прямая реакция с коньюгатом WGA-НRРИнкубация с конъюгатом WGA-НRР в присутствии лактозы8Обработка результатовМетоды вариационной статистики
90, ок. 7) подсчитывали абсолютное и относительное количество клеточных элементов: малых, средних и больших лимфоцитов, лимфобластов, макрофагов, митотически делящихся клеток и гибнущих лимфоцитов. Вычисляли лимфоэпителиальный индекс в морфо- функциональных зонах тимуса: субкапсулярной, внутренней коре, на кортико-медуллярной границе и в мозговом веществе.
В срезах вилочковой железы, окрашенных раствором альцианового синего (рН 2,6) с критической концентрацией хлористого магния (0,2 М) с последующей докраской ядер гематоксилином, изучали динамику абсолютного количества тучных клеток на условной единице площади (4608 мкм2) в периферических отделах долек вилочковой железы и по ходу кровеносных сосудов на границе коркового и мозгового вещества. Для удобства описания тучные клетки, расположенные под капсулой органа условно обозначили "субкапсулярными", а тучные клетки, локализующиеся по ходу кровеносных сосудов кортико-медуллярной границы тимуса - "парамедуллярными" (такие условные обозначения тучных клеток встречаются в работах Стручко Г.Ю., Меркулова Л.М. (2000, 2001) [109, 110]. Вычисляли индекс дегрануляции тучных клеток в процентах к общему количеству тучных клеток [76].
Одновременное выявление кровеносных и лимфатических сосудов микроцир