Вы здесь

Значення проліферативних, адгезивних, активаційних властивостей пухлинних клітин та лімфоцитів для їх взаємодії в динаміці злоякісного росту (експериментально-клінічне дослідження)

Автор: 
Співак Світлана Ігорівна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2002
Артикул:
0402U003585
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

2.1. Тварини.

В експериментальних дослідженнях використовували 350 самців мишей лінії BALB/c (розведення віварію Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького), керуючись міжнародно прийнятими правилами проведення робіт з експериментальними тваринами.

2.2. Моделі пухлинного процесу.

2.2.1. Модель бластомогенезу, індукованого метилхолантреном. Для одержання лінії клітин МХ-рабдоміосаркоми, 40 мишам лінії BALB/c в м'язи правого стегна вводили по 1 мг метилхолантрена в 0,1 мл абрикосової олії. Через 12 тижднів після введення метилхолантрена з'являвся пухлинний вузел.
Для визначення експресії різних поверхневих маркерів та протипухлинної дії лімфоцитів в динаміці росту пухлини, тварин, яким було введено метилхолантрен, забивали під ефірним наркозом по 4 тварини на 4-; 8-; 10-; 12-; 12,5-; 13-; 13,5-; 14-; 14,5-; 15-й тиждень, виділяли пухлинні клітини та лімфоцити з лімфовузлів різної локалізації (регіонарних та віддалених).

2.2.2. Модель перевивної МХ-рабдоміосаркоми. Як модель перевивної МХ-рабдоміосаркоми були використані третя та четверта генерації клітин сарком, первинно индукованих 20-метилхолантреном у сингенних мишей [58]. Клітини перевивного штаму МХ-рабдоміосаркоми, зберігаються у рідкому азоті. Для відтворення моделі перевивної МХ-рабдоміосаркоми клітини розморожували за загально принятими методиками і вводили тваринам пухлинні клітини по 700 тис. клітин під шкіру стегна. На 14-у добу тварин забивали, виділяли пухлинні клітини і вводили 30 мишам. По 6 тварин, яким було перещеплено пухлинні клітини МХ-рабдоміосаркоми забивали на 4-, 7-, 10-, 14-, 17-у добу після імплантації пухлинних клітин, виділяли пухлинні клітини та лімфоцити з лімфовузлів різної локалізації для подальшого вивчення екпресії поверхневих молекул та взаємодії лімфоцитів з пухлинними клітинами в динаміці росту пухлини.

2.2.3. Клінічний матеріал. Пухлинні клітини та лімфоцити периферичної крові отримані від 26 хворих на саркоми м'яких тканин, що знаходились на стаціонарному лікуванні у відділенні пухлин опорно-рухового апарату клініки Інституту онкології АМН України.

2.3. Отримання клітин для дослідження.

2.3.1. Виділення пухлинних клітин тварин. У тварин видаляли пухлини, вирізали фрагменти тканини без судин і некрозу, змільчували їх ножницями до розміру не більше 0,2 мм3, та інкубували 5 хв. при 370 С в 0,2% розчині трипсину (СПОФА, Чехословакія) в середовищі RPMI-1640 (Sigma, USA), при постійному перемішуванні на магнітомішалці. Рідину відбирали, фільтрували через 3 шари капрону і відмивали з додаванням 10% ембріональної телячої сироватки ("Сангва", Україна). Клітини інкубували з трипсином 3 рази. Виділені клітини відмивали 3 рази центрифугуванням при 425 g в культуральному середовищі.

Визначення життєздатності клітин.
5 мкл суспензії відмитих клітин змішували з 45 мкл 0,25% розчину трипанового синього в фізіологічному розчині хлориду натрія і підраховували число життєздатних клітин по включенню трипанового синього в камері Горяєва (об.40, ок. 7).

2.3.2. Отримання пухлинних клітин людини. З біопсійного матеріалу чи видаленої при операції пухлини стерильно вирізали фрагменти тканини без судин і некрозу, змільчували їх ножницями до розміру не більше 0,2 мм3, та інкубували 30 -40 хв. при 370 С в 0,2% розчині коллагенази (Sigma, USA) в середовищі RPMI-1640 (Sigma, USA), при постійному перемішуванні на магнітомішалці. Виділені клітини відмивали 3 рази центрифугуванням при 425 g в культуральному середовищі і підраховували % життєздатності клітин в камері Горяєва при фарбуванні трипановим синім.

2.3.3. Отримання пухлинних біоптатів людини та тварин. З біопсійного матеріалу / видаленої при операції чи у тварин пухлини стерильно вирізали фрагменти тканини без судин і некрозу, змільчували їх ножницями до розміру не більше 0,2 мм3.

2.3.4. Виділення лімфоцитів тварин. Виділяли лімфатичні вузли з пахової області (регіонарні) та області передніх кінцівок (віддалені). Вирізали залишки тканин та судин, та розтирали лімфатичні вузли в гомогенізатирі Поттера. Отримані клітини 3 рази відмивали RPMI-1640 (Sigma, USA), і підраховували % життєздатності клітин в камері Горяєва при фарбуванні трипановим синім.

2.3.5. Отримання лімфоцитів людини. В передопераційний період (до початку наркотизації) з вени хворих брали 5 мл периферічної крові, з якої виділяли лімфоцити за допомогою стандартної методики диференційного центифугування в градієнті плотності (1,077 г/см3) фіколл-верографин. Цільну гепаринізовану кров разводили фізіологічним розчином хлориду натрія в співвідношенні 1:1. В центрифужну пробірку вносили 3 мл градієнтної суміші, на яку наслоювали 7 мл разведеної крові, і центрифугували на протязі 30-40 хв. при кімнатній температурі.
Фракцію лімфоїдних клітин в верхній границі градієнту шприцем з довгою голкою чи пастерівською піпеткою переносили в стерільні пробірки і 3 рази відмивали центрифугуванням в физіологічному розчині по 5 хв, і підраховували % життєздатності клітин в камері Горяєва при фарбуванні трипановим синім.

Градієнт густини фіколл-верографіна.
Для виготовлення фіколл-верографіна використовували 765 чи 60% верографін (Spofa, Угорщина), а також фікол (Pyfrmaсіа, Швеція). 6,3 г фікола розчиняли у 70 мл води з використанням водяної бані і постійному помішуванні. Потім додавали 14,25 мл 76% чи 18,09 60% верографіна. Загальний об'єм доводили до 99 мл водою, показники густини перевіряли за допомогою ареометра.

2.4. Моноклональні антитіла.

Вивчення експресії різних маркерів пухлинних та лімфоїдних клітин тварин та людини проводилося з використанням непрямого імунофлуоресцентного метода [171-175].
На пухлинних клітинах та лімфоцитах мишей вивчали експресію:
1) маркера про