Вы здесь

Імунобіологічний статус у свиней в неонатальний період та вплив на нього риботану, тималіну та левамізолу

Автор: 
Салига Наталія Омелянівна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2003
Артикул:
0403U000588
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріал досліджень
З метою з'ясування впливу імуномодуляторів на формування клітинних і
гуморальних факторів імунітету поросят у ранній період постнатального розвитку
проведено дві серії досліджень на поросятах великої білої породи. У процесі
досліджень визначали імунологічні, фізіологічні, біохімічні показники та
продуктивні ознаки поросят.
Метою першої серії дослідів було вивчити вплив різних доз імуномодулятора
тималіну на імунобіологічну реактивність поросят і встановити оптимальну дозу
та схему введення цього препарату. Дослідження проводились у дослідному
господарстві “Оброшино” на трьох групах поросят, по 5 тварин у кожній, протягом
першого місяця постнатального розвитку. У 10- і 20-добовому віці дослідним
поросятам внутрішньом’язево вводили тималін протягом трьох днів з інтервалом 24
години відповідно у кількостях: тваринам першої дослідної групи (Д1) – 1 і 3 мг
на голову, другої дослідної групи (Д2) – 2 і 4 мг на голову. Поросятам
контрольної групи (К) замість розчину вказаного препарату вводили відповідний
об’єм 0,9% розчину NaCl.
Метою другої серії дослідів було вивчити вплив імуномодуляторів риботану,
тималіну та левамізолу на процеси імуногенезу у поросят. Дослідження
проводились у дослідному господарстві “Дубляни” на 4-х групах поросят по 5
тварин у кожній, починаючи з 3- до 30-ї доби після народження. У 3-, 10-, 20-
добовому віці дослідним поросятам окремих груп вводили імуномодулятор риботан,
тималін та левамізол протягом трьох днів з інтервалом 24 години відповідно у
кількостях: тваринам першої дослідної групи (Д1) – риботан у дозі 0,5 мл на
голову, другої дослідної групи (Д2) – тималін у дозі 3 мг на голову, третьої
дослідної групи (Д3) – левамізол у дозі 3мкг на кілограм живої маси. Поросятам
контрольної групи (К) у вказаний період вводили відповідний об’єм 0,9% розчину
NaCl.
Матеріалом для досліджень була цільна кров, плазма і сироватка крові поросят,
яку відбирали на 3-, 10-, 20- і 30-у доби життя.
Для досліджень використовували венозну кров, одержану від поросят шляхом
пункції передньої порожнистої вени. Як антикоагулянт використовували гепарин.
Для одержання плазми кров центрифугували при 3000 об./хв. протягом 10 хв. Для
отримання сироватки кров ставили в термостат на 1 годину при 37°С. Потім
центрифугували 10 хв. при 1500об./хв.
У цільній крові визначали кількість лейкоцитів, лейкоформулу, число лімфоцитів
окремих субпопуляцій, фагоцитарну активність нейтрофілів, бласттрансформацію
лімфоцитів. У плазмі крові визначали концентрацію гідроперекисів, малонового
диальдегіду, активність глутатіонпероксидази, а у сироватці – бактерицидну,
лізоцимну, комплементарну активність, концентрацію імуноглобулінів та
циркулюючі імунні комплекси.
Цитологічний аналіз клітин крові проводили шляхом фарбування фіксованих
метанолом мазків за методом Романовського-Гімза.
Одержані цифрові дані опрацьовували статистично з використанням програмного
пакету Microsoft Excel для персональних комп’ютерів, достовірність змін
встановлювали за t-критерієм Стьюдента.
2.2. Визначення кількості лейкоцитів у крові поросят
Кількість лейкоцитів підраховували у певному об’ємі камери Горяєва при відомому
розведенні крові [62] .
У пробірку вносили 0,4 мл 3% розчину оцтової кислоти, підфарбованої метиленовою
синькою і 0,02 мл крові за допомогою капілярної піпетки. Кров у пробірці добре
перемішували, закорковували і залишали на 4 хв. Камеру Горяєва знежирювали
етанолом і притирали до неї покривне скельце. Брали краплю крові і наносили до
краю шліфувального скла камери. Підрахунок лейкоцитів розпочинали через 1 хв
після заповнення камери. лейкоцити підраховували під мікроскопом,
використовуючи мале збільшення (об’єктив – 8х, окуляр – 10х) при затемненому
полі зору в 100 великих квадратах. Розрахунок проводили за формулою (2.1).
(2.1)
де Х – кількість лейкоцитів у 1 мкл крові;
а – кількість лейкоцитів, підрахованих у 100 великих квадратах;
1600 – кількість малих квадратів;
20 – розведення крові;
4000 – множник, який приводить результат до об’єму 1 мкл крові, оскільки об’єм
одного малого квадрату становить 1:4000 мкл.
2.3. визначення кількості Т- і В- лімфоцитів та їх субпопуляцій у крові методом
розеткоутворення (Е-РУЛ і ЕАС-РУЛ)
За допомогою цього методу визначали кількість Т- і В- лімфоцитів та їх
субпопуляції [149]. Наявність різних маркерів і рецепторів на поверхні
лімфоцитів дозволяє диференціювати їх один від одного. Однією з характерних
ознак Т-лімфоцитів тварин є присутність на їх поверхні рецепторів для
гетерогенних еритроцитів. В-лімфоцити на клітинній мембрані окрім власних
імуноглобулінів містять рецептори для Fc фрагменту і третього компоненту
комплементу (С3). Визначення цих функціональних структур покладено в основу
методів визначення кількості Т- і В-клітин крові.
Лімфоцити виділяли в градієнті густини фікол-верографіну. Кількість лімфоцитів
підраховували в камері Горяєва, доводячи їх кількість до 1,5-2,5 млн./мл.
Еритроцити барана (ЕБ) 3-4 рази відмивали забуферним фіз. розчином (ЗФР) шляхом
центрифугування 10 хв. при 1500 об/хв. З них готували 0,5% розчин ЕБ. Для
В-лімфоцитів готували ЕАС-систему (еритроцити сенсибілізовані антитілами і
комплементом). Цю систему готували таким чином: до 2 мл 2,5% ЕБ додавали 2 мл
розведеної гемолітичної сироватки та інкубували 30 хвилин при 37°С. Потім суміш
центрифугували 10 хв. При 1500 об/хв. Відбирали надосад, а до осаду додавали 4
мл ЗФР і знову центрифугували 10 хв. при 1500 об./хв. До цієї суміші додавали 2
мл розведеного комплементу, і знову інкубували та центрифугували у попередньому
режимі