Вы здесь

Ефективність малоінвазивних методів лікування гострого деструктивного панкреатиту за умов корекції імуноло-гічного статуса інтерфероном

Автор: 
Бородаєв Ігор Євгенович
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2003
Артикул:
0403U000992
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

ГЛАВА 2
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ
2.1. Клинико- лабораторные методы исследований
2.1.1. Б и о х и м и ч е с к и е м е т о д ы. Было исследовано 45 образцов
некротизированной ткани (27- у больных ОП, 11- стенка кисты ПЖ и 7- ткань ПЖ
после травмы органов брюшной полости с летальным исходом), которые замораживали
в жидком азоте и после лиофильной сушки сохраняли при - 60оС. Образцы ткани
обезжиривали смесью хлороформа и метанола и освобождали от органических
веществ. Определяли уровень уроновых кислот, гексозаминов, оксипролина (в мг/г
сухой ткани), активность b-галактозидазы и b-глюкуронидазы по [Абрамов Ю.В. и
соавт., 1999]. Ретроспективно (через 2 месяца с момента оперативного лечения)
проводили анализ биохимических показателей и динамики (исхода) заболевания.
Состояние тиол- дисульфидной системы изучалось по показателям содержания общих,
белковых, небелковых сульфгидрильных (SH) и дисульфидных (SS) групп, а также
коэффициента SH/SS. Исследования проводились методом амперометрического
титрования на 10-е сутки с момента оперативного вмешательства [Соколовский
В.В., 1996]. Поскольку ранее было определено выраженное изменение в системе
тиол- дисульфидного контроля у больных ОП [Запорожченко Б.С., 1998;
Запорожченко Б.С., Шишлов В.И., 1999], мы исследовали данные показатели у
больных на пятые сутки с момента начала применения различных методов
комплексного лечения
2.1.2. И м м у н о л о г и ч е с к и е м е т о д ы. Субпопуляции лимфоцитов
подсчитывали исходя из экспрессии дифференцировочных антигенов на поверхности
клеток. Для идентификации поверхностных структур Т- и В-лимфоцитов (CD3 и
CD19), субпопуляций Т-клеточного звена (Т-хелперы (CD4), Т-супрессоры (CD8),
естественных киллеров (CD16) использовали метод прямой иммунофлюоресценции. с
помощью соответствующих моноклональных антител фирм "Ortho Diagnostic System"
[Меньшиков В. В. и соавт., 1987]. Лунки парафильма, прикрепленного на
предметном стекле, заполнялись по 20 мкл поли-L-лизином в концентрации 50
мкг/мл. Спустя 30 минут инкубации при 37° С в лунки, отмытые дважды в среде
199, вносилась исследуемая суспензия клеток по 20 мкл в концентрации 1х106/мл.
Через 45 мин инкубации (37° С) к осадку лимфоцитов, предварительно
освобожденных от надосадочной жидкости, добавлялись соответствующие
моноклональные антитела (по 20 мкл). Инкубация продолжалась еще 30 минут при
20°С, после чего иммобилизированные клетки отмывали трижды средой 199. В лунки
вносили 50 % глицерин, накрывали их покровным стеклом и при помощи
люминисцентного микроскопа "Люмам-1" учитывали наличие флюоресценции мембран
200 клеток.
Для оценки сбалансированности Т-клеточного иммунитета рассчитывали
иммунорегуляторный индекс (ИРИ), который предсталяли как соотношение хелперных
и супрессорных лифоцитов (CD4/CD8).
Функциональная активность Т-клеточного иммунитета определялась реакцией
бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) с фитогемагглюти-нином (ФГА)
[Меньшиков В. В. и соавт., 1987].
Функциональную активность В-лимфоцитов характеризует уровень неспецифических
иммуноглобулинов в сыворотке крови. Содержание Ig G, А, М определялось методом
радиальной иммунодиффузии [Mancini G. et al., 1965] с использованием
соответствующих антисывороток производства Московского НИИ вакцин и сывороток
им. И. И. Мечникова.
Уровень иммунных комплексов определяли с помощью полиэтиленгликоля MB 6000,
растворенного в боратном буфере [Гриневич Ю.А., Алфёров А.Н., 1981]. В 2
пробирки вносили по 0,38 мл разведённой сыворотки крови. В 1-ю (контроль)
добавлялось 4 мл боратного буфера, во 2-ю (опыт) - 4 мл раствора
полиэтиленгликоля. Содержимое пробирок тщательно перемешивали и инкубировали
при 20-22°С 60 мин. Оптическая плотность измерялась на спектрофотометре в
кварцевых кюветах (1х1 см) при длине волны 450 нм.
Сенсибилизацию организма к тканевым антигенам определяли с по­мощью реакции
торможения миграции лейкоцитов по величине индекса миграции (ИМЛ): ИМЛ= (Rо2-
r2)/ (Rk2- r2), где Rо2- и Rk2 - радиусы зон миграции лимфоцитов в опыте и
контроле, соответственно, r - радиусы миграции в отсутствие сенсибилизации
[Mancini G. et al., 1965].
Гемолитическая активность комплемента определялась по 50 % гемолизу
унифицированным методом [Гриневич Ю.А., Алфёров А.Н., 1981]. Фагоцитарную
активность лейкоцитов, фагоцитарный индекс (ФИ) и интенсивность фагоцитоза
(фагоцитарное число) определяли стандартным методом [Методические рекомендации
по унифицированным методам лабораторной диагностике. — М„ 1996. - 236 с.].
Для оценки функциональной активности лейкоцитов использовали тест
восстановления нитросинего тетразолия, принцип которого в цитохимическом
выявлении "метаболического взрыва", возникающего в нейтрофилах при их активации
[Park B.H., 1968]. Мазки изготавливались из смеси, состоящей из 0,1 мл крови,
0,05 мл 0,15 М раствора фосфатного буфера (рН=7,2) и 0,05 мл 0,2 % раствора NST
фирмы "Лахема", через 30 мин инкубации при 37° С. Активность нейтрофилов
рассчитывали по формуле: (а+2b+3с)/n, где а, b и с - процент клеток с
включениями (нерастворимые гранулы диформазана), занимающими соответственно до
1/3, от 1/3 до 2/3 и более 2/3 площади клетки.
Использование подобного набора иммунологических методик позволяет давать
комплексную оценку имеющим место изменениям и объективизировать картину
развивающегося заболевания [Соколов Е.И., 1998].
Для лечения пациентов мы применяли созданный в ИМБиГ НАН Украины
генно-инженерный рекомбинантный «Лаферон», идентичный лейкоцитарному а2b-ИФН
человека.