Вы здесь

Вплив алогенної трансплантації ембріональної нервової тканини на морфо-функціональний стан зорового аналізатора при отруєнні метиловим спиртом .

Автор: 
Радченко Майя Ростиславівна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2003
Артикул:
3403U002477
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

2.1. Ретроспективний аналіз і клінічна характеристика хворих на атрофію зорового нерва

Для проведення ретроспективного аналізу було опрацьовано 8202 історій хвороб пацієнтів, що перебували на лікуванні в очному відділенні Центральної міської клінічної лікарні м. Києва у 2000-2002 роках. Ретроспективний аналіз був здійснений на 174 історіях хвороб з діагнозом атрофія зорового нерва. У 57 пацієнтів нами проведено стаціонарне лікування з подальшим дво- та трирічним амбулаторним контролем гостроти і сумарного поля зору з метою визначення подальшої динаміки патологічного процесу.

2.2. Характеристика експериментальних моделей, що використову-вались в роботі

У роботі використано 95 кроликів самців породи Шиншила (маса тіла 3,0-3,2 кг). Моделювання ураження зорового нерва проводили шляхом внутрішньовенного введення метилового спирту в дозі 1,8 г на кг маси тіла, розводячи метанол 0,9% розчином натрію хлориду вдвічі.

Для експериментального обґрунтування способу лікування АЗН при інтоксикації метанолом за допомогою алогенної трансплантації ембріо-нальної нервової тканини останню імплантували інтракраніально під обо-лонки уражених зорових нервів, що забезпечує безпосередній контакт ре-гіональних стовбурових клітин з ураженими ділянками n.opticus. Трансплантацію ембріональної нервової тканини проводили через 3 доби після введення метанолу.
Для трансплантації використовувалася тканина головного мозку 14-добових ембріонів, отриманих шляхом кесарського розтину вагітної самки, який проводили в стерильних умовах під внутрішньовенним наркозом сумішшю каліпсолу та реланіуму на 0,9% розчині натрію хлориду (50 та 10 мг на кг маси тіла, відповідно). Виділення головного мозку виконувалося під мікроскопом за стерильних умов з використанням мікрохірургічного інструментарію. Головний мозок ретельно вивільняли від оболонок, розрізали на фрагменти розмірами 0,1-0,2 мм3, відмивали в ізотонічному розчині натрію хлориду і розміщували в стерильних чашках Петрі із середовищем 199 в термостаті при температурі 37,5оС. Об'єм трансплантата становив 0,15?0,05 мм3.
Трансплантацію ембріональної нервової тканини проводили через субфронтальний інтракраніальний доступ до зорового нерва. Після асеп-тичної обробки операційного поля м'які тканини розрізали перпендикулярно верхньому краю орбіти на межі внутрішньої і середньої третин. Довжина розрізу становила 4-5 см. М'які тканини розводилися розширювачем Янсена. Кістка у місці трепанації на площі 3,5 ? 3,5 см звільнялася від окістя за допомогою распатера. За допомогою фрези і пістолетних щипців Кюрісона виконували резекційну трепанацію черепа. Тверда мозкова оболонка в площині трепанаційного вікна розтиналася хрестоподібно та фіксувалася вузловими швами. Надалі операційне втру-чання виконували з використанням операційного мікроскопа. Обережно мозковим шпателем припіднімали полюс лобної долі головного мозку, чим забезпечувався доступ до інтракраніальної частини зорового нерва від місця виходу з однойменного каналу до хіазми. Очним скальпелем надсі-кали м'яку мозкову оболонку на відстані 2-3 мм від виходу нерва із зоро-вого каналу та проводили трансплантацію.
Введення трансплантатів виконували за допомогою пристрою, що складався з градуйованої мікроподачі, мікрогвинт якої жорстко зчеплювався з поршнем мікрошприца Гамільтона. До шприца приєднувалася поліхлорвінілова трубочка, кінець якої з'єднувався зі скляною канюлею L-подібної конфігурації, що потоншувалася в дистальному напрямку. Вся система заповнювалася поживним середовищем 199. За допомогою мікрогвинта фрагмент ембріональної нер-вової тканини засмоктувався в кінчик скляної канюлі і поступовим зворот-ним обертанням мікрогвинта вичавлювався під оболонки зорового нерва. Тваринам групи порівняння виконували всі етапи операції, але замість ембріональної нервової тканини вводили 0,15-0,20 мкл середовища 199. Контрольну групу склали 5 здорових кроликів.

2.3. Методи дослідження функціонального стану зорового аналіза-тора

Контроль ефективності лікування проводили за допомогою викли-каних електропотенціалів, що є об'єктивним методом дослідження функ-ціонального стану нейронального апарату ока [50]. Численні дослідження засвідчують, що застосування цієї методики в клініці сприяє більш якісній діагностиці, дозволяє визначити рівень ураження і оцінити динаміку пато-логічного процесу та ефективність лікування [53,142]. Зокрема, Міжнарод-не товариство клінічних електрофізіологів зору радить проводити електро-фізіологічні дослідження для оцінки функції зорового нерва при травмі, сидерозі, симпатичній офтальмії, ендофтальміті [223].
Для запису електропотенціалів ми використовували комп'ютеризований комплекс електрофізіологічної системи "B.A.S.I.S.EPM" (OTE Biomedica, Італія). Потенціали реєстрували при бінокулярній стимуляції на відстані 15 см. Для світлової стимуляції застосовували світлодіодні спалахи білого кольору з довжиною хвилі 640нм, інтенсивністю 600 мКд, потужністю 0,25 Дж і тривалістю 1,9 с. Активні електроди накладали в потилично-тім'янній області, близькою до зорової проекційної зони кори, індиферентний електрод накладали в лобній області по середній лінії. Накопичували 200 біоелектричних відповідей. Епоха аналізу зорової викликаної активності складала 500 мс.
Дослідження очного дна з визначенням стану ДЗН проводили шля-хом фотографування прибором "Ретинофот" (модель 211, Карл Цейс, Ні-меччина). Кролика сповивали і після розширення зіниці 1%-им розчином атропіну сульфату (1-2 рази) виконували фотографування очного дна.

2.4.Характеристика морфологічних і біохімічних методів досліджен-ня

Для електронномікроскопічного дослідження проводили забір фрагментів тканини мозку експериментальних тварин розміром 1 ? 1 мм3 відразу після декапітації тварин та фіксували в суміші 4%-ного параформальдегіду, 2,5%-ного глютарового альдегіду і 4%-ної сахарози на сантімолярно