Вы здесь

Морфологічні критерії корекції мексидолом змін в печінці щурів після кріодеструкції шкіри

Автор: 
Маєвський Олександр Євгенійович
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2004
Артикул:
0404U000485
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
ЗАГАЛЬНА МЕТОДИКА ТА ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Загальна методика та об'єкти дослідження
Нами проведено експеримент на 165 білих статевозрілих щурах-самцях популяції Вістар віком 3 місяці з початковою масою тіла 180-205г. Тварини після попереднього двохтижневого карантину були розділені на 3 групи: 1 група - інтактні щурі, які утримувались у звичайних умовах віварію; 2 група - щурі, яким проводили кріодеструкцію шкіри площею 9-10 % тіла на глибину включно до підшкірної основи; 3 група - тварини з аналогічною площею та глибиною кріодеструкції шкіри, яким попередньо протягом 7 діб перорально вводили мексидол (розведений в ізотонічному розчині хлориду натрію) з розрахунку 50 мг/кг маси тіла. Ця доза найбільш часто використовується при проведенні експериментальних досліджень [32] і згідно з результатами, отриманими О.В.Паламарчук [63], не викликає достовірних морфологічних і біохімічних змін у печінці інтактних щурів. Розподіл тварин за групами та методами досліджень представлений у таблиці 2.1.
Таблиця 2.1
Розподіл тварин за групами та методами досліджень.
ГрупаМакрометричні та світлова мікроскопія Електронна мікрос-копіяКонтроль4015Кріодеструкція4015Кріодеструкція+мексидол4015
Протягом усього експерименту за тваринами проводили систематичний нагляд. У приміщенні постійно підтримували температуру на рівні 24-25 ?С. Всі тварини утримувались в умовах віварію згідно з "Правилами проведення робіт з використанням експериментальних тварин". Годування проводили 2 рази на добу, воду не обмежували.
Після попереднього внутрішньочеревного тіопенталового наркозу (з розрахунку 30-40 мг на 100 г маси тіла) тварин виводили з експерименту шляхом декапітації через 1, 3, 7, 14, та 28 добі після проведення кріодеструкції шкіри. Для подальшого морфологічного дослідження була обрана печінка щурів.

2.2. Моделювання кріодеструкції шкіри

Під тіопенталовим внутрішньочеревним поверхневим наркозом (з розрахунку 25 мг/кг маси тіла) проводили депіляцію шкіри спини та лівого боку щурів за допомогою безпечної бритви. Після виходу тварин із наркозу, кріодеструкцією шкіри загальною площею 9-10 % поверхні тіла на глибину включно до підшкірної основи (рис. 2.1) викликали прикладанням на 6 секунд двох мідних пластин (кожна площею 14,5 см2), які попередньо занурювали на 5-7 хвилин у рідкий азот (рис. 2.2) [18, 48]. Температура мідних пластин на момент прикладання до шкіри складала -196 °С.

2.3. Макроскопічні методи дослідження

Масу тварин визначали на чашкових вагах з точністю до 1 г. Абсолютну масу печінки - на торсіонних техніко-хімічних вагах I-го класу типу
Рис. 2.1. Деструктивні та дистрофічні зміни в шкірі щурів через добу після її кріодеструкції. Гематоксилін-еозин. х100.
Рис. 2.2. Зовнішній вигляд рани у щурів через 3 доби після кріодеструкції шкіри.
Т-200, з межею навантаження 200 г (точність при 10 % навантаженні ±25 мг).
Відносну масу печінки розраховували за формулою:

Мвідн = абсолютна маса печінки (мг) / маса тіла (г) х 100.

Лінійні розміри печінки (найбільша довжина, ширина і товщина) визначали за допомогою штангенциркуля з точністю до 0,1 мм. Для цього печінку розкладали задньою поверхнею на планшеті, який був змочений кров'ю, що давало можливість правильно і однаково орієнтувати кожну її частку (рис. 2.3). Довжину вимірювали між найбільш віддаленими точками лівої і правої зовнішніх часток; ширина відповідала поперечині найбільшої частки - лівій зовнішній; а товщина - складала відстань між найбільш виступаючою над планшеткою частиною передньої поверхні печінки, що відповідає правій зовнішній частці.

Рис. 2.3. Схема укладки печінки для виконання макрометричних досліджень:
1 - ліва зовнішня частка;
2 - ліва внутрішня частка;
3 - права внутрішня частка;
4 - права зовнішня частка.
2.4. Гістологічні методи дослідження

Зразки органа для мікроскопічного дослідження в усіх випадках брали з лівої бокової частки печінки. Шматочки печінки, розміром не більше 10х10 мм фіксували в 10 % розчині нейтрального формаліну. Після фіксації матеріал промивали, зневоднювали в серії спиртів зростаючої концентрації, проводили через хлороформ та заливали в парафін [14]. На ротаційному мікротомі готували зрізи товщиною 6-8 мкм, профарбовували гематоксилін-еозином та заливали на склі в канадський бальзам.
Гістологічне дослідження печінки проводили на мікроскопі Labor-lux S (Leitz) при збільшеннях: 10/0,25х10, 40/0,65х10 та 100/1,25х10.

2.5. Ультраструктурні методи дослідження

Під тіопенталовим наркозом щурам у черевну порожнину in situ вводили 2,5 % розчин глютарового альдегіду. Через 15-20 хвилин шматочки печінки вирізали й фіксували у тому ж розчині протягом години. Потім матеріал проводили за стандартною методикою в 1 % розчині чотирьохокису осмію на фосфатному буфері, 1 % розчині танінової кислоти, зневоднювали в спиртах зростаючої концентрації та ацетоні, проводили в сумішах ацетону та епону і заливали в капсулах чистим епоном [168].
За загальноприйнятою методикою готували напівтонкі і ультратонкі зрізи на ультрамікротомі Рейхард (Німеччина). Напівтонкі зрізи накладали на предметне скло та фарбували в 1 % розчині метиленового синього. Ультратонкі зрізи укладали на мідні сітки та контрастували уранілацетатом та цитратом свинцю по Рейнольдсу [168]. Фотографування виконували на електроних мікроскопах Hitachi-9A та Hitachi-12A (Японія).

2.6. Методи мікроморфометрії та математичного аналізу

Тканинний стереологічний аналіз проводили за допомогою сітки Вейбеля, накладеної на демонстраційний екран мікроскопа Laborlux S (Leitz) при збільшеннях 40/0,65х10 та 100/1,25х10 [158, 174]. Він включав в себе визначення:
1. Об'ємної густини (відносний об'єм, см3/см3) пошкоджених гепатоцитів взагалі за формулою