Вы здесь

Прогнозування циркуляції та розвитку фітовірусних інфекцій з урахуванням біологічних властивостей патогенів та використанням комп'ютерних баз даних.

Автор: 
Дем\'яненко Федір Петрович
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2004
Артикул:
0404U000548
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
2.1. Рендомізований польовий експеримент
Метод виявлення та відбору рослинного матеріалу за зовнішними симптомами є найпростішим і найпоширенішим методом. Він заснований на здатності багатьох вірусів викликати характерні симптоми ураження рослин, які проявляються у вигляді смугастості листкових пластинок, їх деформацій, вкорочування стебел та пагонів, зміні забарвлення листя, появі некротичних плям та ін.
Загальний стан поля обстежувався за такими параметрами : фаза розвитку рослин в онтогенезі, вид рослини, стан посiвiв, кiлькiсть рослин-бур'янiв, процент рослин з симптомами вiрусних захворювань. Для обстеження поля цукрового буряку вибиралися три дiлянки площею 100 м2, де пiдраховувалась кiлькiсть рядкiв, кiлькicть рослин у кожному рядку i кiлькiсть рослин з симптомами вiрусних захворювань на листкових пластинках у кожному рядку. Пiдрахунок інших культур, якi мали симптоми вiрусного ураження, проводився: кукурудзи, соняшнику 3 - х 100 м2; пшеницi - 3 х 1 м2. Також вiдмiчалися симптоми, якi переважали (47 ).
Рендомізоване розміщення виборок та варіантів запропоновано Р.А. Фішером (Англія) на основі розробленого ним дисперсійного аналізу. Воно сприяє кращому охопленню кожним варіантом неоднорідності родючості грунтів, виключає можливу систематичну зміну родючості всередині повтору та усуває його однонаправлений вплив на результати досліду. Використання випадкових способів розподілу - одна з характерних особливостей сучасного періоду розвитку методики польового досліду. В дослідах, де варіанти розміщені систематично, ми, власне кажучи, втрачаємо можливість спиратися при оцінці даних на достатньо надійний критерій суттєвості, який використовується в дисперсійному аналізі (79).
В умовних дослідах при відсутності фактичних ефектів варіантів варіювання середніх врожаїв не повинно суттєво відрізнятися від випадкового, тобто дисперсії по рядку "варіанти" та "залишок" (S2V та S2) повинні бути близькі за своїми значеннями. Це і досягається при рендомізації (S2V =4,28 та S2=3,72), тоді як при систематичному розташуванні дисперсія не однакова (9,51 та 1,98), а критерій F вказує на суттєву різницю середніх по варіантах. Як наслідок, при систематичному розташуванні варіювання середніх врожаїв обумовлено не лише випадковим, але й закономірним територіальним фактором, що і може призвести до ілюзії суттєвої дії умовних варіантів. В цих умовах критерій F є ненадійною базою для оцінки результатів досліду та втрачає свою законну силу. Як наслідок зрозуміло, що при систематичному розміщенні варіантів експериментатор отримує невірну оцінку похибки середніх. Тому, якщо судити про якість дослідної роботи по похибці досліду, можна зробити помилковий висновок про переваги систематичних методів (Доспехов, 1973).
Якщо значення дисперсії похибки, отримане при різних методах розміщення, виразити в процентах до теоретично очікуваної, прийнявши її за 100 відсотків, то ефективність систематичного розположення складає лише 51,3%, а рендомізованого -96,4% .

2.2. Вiдбiр i пiдготовка зразків для аналізів
Для досліджень росповсюдження вірусів з полів сільськогосподарських культур (таких як злакові, цукровий буряк, картопля) та необроблюваних ділянок (заповідників, балок та ін.) відбирали зразки культурних рослин, супутніх бур"янів та грунту в трьох повторностях з трьох точок методом рендомізованого польового експерименту та вносили в стерильний пакет. Вiдбиралися лише комплекснi проби , кожна з яких складалася з рослинного зразка та грунту пiд ним. Відбір грунту проводився на різній глибині: 10, 20, 40 см. Для препаративного виділення та накопичення вірусів відбиралися зразки культурних рослин та рослин-індикаторів з візуальними симптомами вірусного ураження. Дослідження проводилися в чотирьох регіонах України, таких як: Волинська область, Шацький Національний парк; Київська область, Богуславський полігон, Харківська область, район Змієвської ДРЕС та Одеська область, район Комінтерново (Рис 2.1.).
Аналіз зразків проводили за наведеною схемою (Рис.2.2.). Після відбору зразки гомогенізували з буфером (0,01 М фосфато-сольовим буферним розчином (рН 7,2-7,4)) в шутель-апараті протягом ночі. Потім проводили виділення та очистку вірусу (7). Для цього розчинений у буфері зразок піддавали серії центрифугувань: низькошвидкісне центрифугування на центрифузі РС-6 (5000 g 20 хвилин; відбирався надосад). Високошвидкісне центрифугування проводили на центрифузі фірми "Beckman" (70000 g 60 хвилин), після чого осад ресуспендували в буфері. За час ультрацентрифугування осідають вірусні частки та компоненти клітин. Потім частина отриманого матеріалу використовувалася для зараження рослин-індикаторів (найчастіше всього Datura stramonium, Nicotiana tabacum та Chenopodium amaranticolor), а частина - для імуноферментного аналізу (ІФА) та електронної мікроскопії (ЕМ). Для передачі вірусів на рослини-індикатори застосовували кілька пасажувань. Проби з рослин - індикаторів відбирали для імуносорбентної електронної мікроскопії (ІСЕМ) та електронної мікроскопії.
2.3. Імуноферментний аналіз
На стадії обробки польових зразків використовували непрямий метод постановки ІФА - das-ELISA (30).
Для його проведення (Рис. 2.2.) використовували антитіла, специфічні до таких вірусів:
* вiрус смугастоi мозаiки пшеницi (ВСМП)-МДУ (Росія), в розведенні 1:100;
* вiрус жовтоi карликовостi ячменю (ВЖКЯ)-МДУ, Росія , в розведенні 1:100 ;
* вiрус штрихуватоi мозаiки ячменю (ВШМЯ)-MSU, USA, в розведенні 1:100;
* вiрус мозаiки цукрового буряку (ВМБ)-МДУ, в розведенні 1 : 100 ;
* вiрус жовтяницi цукрового буряку (ВЖБ)-КДУ, в розведенні 1 : 100;
* вірус некротичного пожовтіння жилок буряку (ВНПЖС) - ІБОХ РАН (Москва, Росія), в розведенні 1:100;
* вiрус слабкого пожовтiння цукрового буряку (ВСПБ)-RES, UK, в розведенні 1 : 100 ;
* Х-вiрус картоплi (ХВК)- Інститут сільськогосподарської мікробіології УААН, Чернігів (ІСМ УААН), в розведенні 1: 25; ДВНЦ РАН, Владивосток;
* У-вi