Вы здесь

Дослідження антивірусної активності гетерополіядерних координаційних сполук перехідних металів на різних рівнях взаємодії вірус-рослина

Автор: 
Харіна Алла Володимирівна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2004
Артикул:
0404U002008
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1.Об'єкти
2.1.1. Віруси
Об'єктами досліджень були вірус тютюнової мозаїки (U1), Х-вірус картоплі, вірус мозаїки цибідіуму та вірус кільцевої плямистості одонтоглосуму, бактеріофаг Т4.

2.1.2. Рослини
В роботі використовувались рослини тютюну сорту Імунний 580 та Трапезон, Datura stramonium, Cymbidium hybridum hort.

2.1.3. Гетерополіядерні координаційні сполуки перехідних металів
Нами досліджувались гетерополіядерні координаційні сполуки перехідних металів отримані на кафедрі неорганічної хімії Київського національного уневерситету імені Тараса Шевченка шляхом прямого синтезу [28, 28, 31, 124]. Досліджувані сполуки представлені в таб. 2.1.
Таблиця 2.1.
Формули та молекулярна маса гетерополіядерних координаційних сполук перехідних металів
№ФормулаМолек. маса66CuNiBr(Ea)3?HEa
HEa - моноетаноламін443.4688Cu2Ni3Br4(Me2Ea)6
НMe2Ea - 2-(диметил)аміноетанол991.71продовження таблиці 2.1. 12372Cu(En)2NiCl4
En - етилендіамін384.26221[CuII2CoIICoIII2(CH3COO)4(H2Tea)2(Tea)2]?2CH3COOН
H3Tea - триетаноламін1248.87288Cu0,5Co0,5(H2Tea)Cl244.84289Cu0,67Co0,33(H2Tea)Cl245.63290Cu0,33Co0,67(H2Tea)Cl2440.5377[Cu2Co2(Dea)4(H2Dea)2]Br2·2ДМСО
H2Dea - діетаноламін, ДМСО - диметилсульфоксид1105.63379[Cu2Co2(Dea)4(H2Dea)2]Br2·2H2O·2CH3OH1127.64380CuCo2Br2(Ea)6701.65283[Cu2Co2(Dea)4(H2Dea)2]І2·2ДМСО1345.84436[Cu2Co2(Dea)4(H2Dea)2]Cl2·2H2O974.65491[Cu2Co2(Dea)4(H2Dea)2](NCS)2·2CH3OH1047.97446[Cu2Co2(Dea)4(H2Dea)2](CH3COO)2·2CH3OH1049.89463[Cu2Co2(Dea)4(H2Dea)2]І21267.73718Cu2Ni3Cl4(HDea)6·2ДМФА
ДМФА - диметилформамід1216,11РО39[Cu(En)2ZnCl4]·ДМСО469,05РО80[Cu(En)2Zn(CH3COO)4]485,29РО172[Cu(En)2ZnCl4]·ДМФА464,04РО239[Cu(En)2CdCl4]ДМФА510,78Sh24[NiLZnCl4], L = 4,6,6,-діаміно-3,7-діазанона-3-ен466,26Sh326[NiLZnBr4], L = 4,6,6,-діаміно-3,7-діазанона-3-ен644,06
2.2. Матеріали та реактиви, які були використані в роботі
При виконанні роботи були використані наступні реагенти:
- карборунд - Броварський завод алюмінієвої металургії;
- поліетиленгліколь 6000; -уранілацетат, полівінілформальдегід; кумасі блакитний R-250;N-n-нітрофенілфосфат ("Serva", США);
- додецилсульфат натрию ("Merk"Німеччина);
- набір маркерних білків для електрофорезу LMW ("Pharmacia", Швеція);
- гліцин, акриламід, біс-акриламід ("BDH"Англія);
- неорганічні компоненти буферних систем та поживних середовищ вітчизняного виробництва марок "хч" та "чда";
- етанол - "Укрзооветромпостач";
- 96-лункові планшети ("Labsystems", Фінляндія);
- 1-см. кювети кварцеві для спектрофотометрії ( "Hitach"Японія);
- антивидові імуноглобуліни (антикролячі), кон'югованні з лужною фосфатазою ("Sigma", США);
- фітогормони ("Sigma", США).
2.3. Методи досліджень
2.3.1 Виділення та очищення бактеріофагу Т4 в рідкому середовищі
Для виділення б\ф Т4 проводили накопичення компетентної культури E.coli В у 100 мл. колбі з поживним середовищем LB:
Бактотриптон 1%
Дріжджовий екстракт 0,5%
Хлорид натрію 1%.
Вирощували бактерію в рідкому поживному середовищі (12 годин при 370С). Доводили розчин до 150мл та залишали на шутелі в термостаті при 37оС 4 години. Доводили розчин до 500мл і знову залишали на шутелі в термостаті при 37оС 3 години. Коли концентрація компетентних клітин досягала 108 кл/мл (перевіряли по стандарту мутності) додавали 25мкл фагу і залишали на ніч у термостаті при 37оС (на шутелі).
Суспензію центрифугували при 3000 об/хв (20 хв) на центрифузі РС-6.
Додавали хлороформ в об'ємі 1:5. Ультрацентрифугували (центрифуuга "Beckman", режим роботи: 60хв при 20000 об/хв).
Далі використовувався метод центрифугування в градієнті щільності сахарози: 20-30-40-50%. Режим роботи: 60хв при 20.000 об/хв. Ротор SV-60. Бактеріофаг збирався в нижній частині пробірки. Осад ресуспендували в PBS РН-7,4. Реальний титр бактеріофагу становив 12*1010/мл.

2.3.2. Виділення та очищення BTM
Для препаративного виділення та подальшого накопичення вірусу відбирали зразки рослин з візуальними симптомами вірусного ураження, з яких готували інокулят. Чутливі рослини інокулювали маханічно за допомогою абразиву (карборунд).
Високоочищений препарат BTM отримували за допомогою диференційного центрифугування [81]. Першим етапом очистки BTM було низькошвидкісне центрифугування гомогенізованих в ФСБ з додаванням ЕДТА вірусвмісних рослинних препаратів. Цей етап дозволив видалити із суспензії зайві рослинні рештки (незруйновані клітини, фрагменти оболонки та ін.). Наступним етапом було освітлення вірусної суспензії з використанням хлороформу, після якого відібрали водну фазу, яка містила вірусні частки. Далі для концентрації та очистки вірусів додавали ПЕГ до концентрації 5 % та NaCl для створення потрібної йонної сили. У таких умовах вірусні частки після 12 год інкубації при +4 0С адсорбуються на ПЕГ і осідають навіть після низькошвидкісного центрифугування. Осад вірусу далі ресуспендували в 10-15 мл 0,01 М калій-фосфатному буфері для подальшого високошвидкісного центрифугування з метою виділення ПЕГ та подальшої очистки. Після диференційного центрифугування в режимі 30 000об/хв протягом 1,5 год проводили додатковий етап очищення через 20 % сахарозну подушку. Концентрацію BTM, що становила 10 мг/мл, визначали спектрофотометрично за формулою:

С = А260*N/Ке
де С - концентрація вірусу в мг/мл,
А260 - екстинція при довжині хвилі 260 нм,
N - розведення вірусного препарату,
Ке - коефіцієнт екстинції, що для BTM становить 2,7 [8].

2.3.3. Виділення та очищення ХВК
Накопичення XBK проводилося на рослинах, що дають системну реакцію на ураження даним вірусом, а саме Nicotiana tabacum (сорт Trapeson, Samsun), які збирали на 21 день ураження. Виділення та очищення XBK проводили за наступною методикою: наважку, попередньо замороженого рослинного матеріалу, гомогенізували з додаванням 0,1 М Ф