Вы здесь

Експериментальні дані про роль пероксидного окиснення ліпідів у розвитку кальцинозу кровоносних судин, зумовленого гіпервітамінозом D

Автор: 
Гарбузова Вікторія Юріївна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2004
Артикул:
0404U002108
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідження виконано на 75 кролях масою від 1800 до 2600 г, віком 6-8 місяців обох статей. Тварин утримували в стандартних умовах віварію. Досліди здійснювали відповідно до "Правил проведення робіт з експериментальними тваринами" [69]. У таблиці 2.1 наведено розподіл експериментальних тварин по серіях дослідів.

Таблиця 2.1
Розподіл експериментальних тварин по серіях дослідів
№ п/пУмови експериментуКількість тваринВивчені показники1Контроль11Вміст гідропероксидів ліпідів Вміст Шиффових основ Глютатіонпероксидазна активність
Каталазна активність
Супероксиддисмутазна активність
Вміст води
Об`єм інулінового простору
Вміст кальцію
2Вітамін D2 - 10000 МО/кг
протягом 1 доби6Вміст гідропероксидів ліпідів
Вміст Шиффових основ
Глютатіонпероксидазна активність
Каталазна активність
Супероксиддисмутазна активність3Вітамін D2 - 10000 МО/кг протягом 3 діб6Вміст гідропероксидів ліпідів
Вміст Шиффових основ
Глютатіонпероксидазна активність
Каталазна активність
Супероксиддисмутазна активність
Вітамін D2 - 10000 МО/кг протягом 7 діб
Вміст гідропероксидів ліпідів
Вміст Шиффових основ Глютатіонпероксидазна активність
Каталазна активність
Супероксиддисмутазна активність
5Вітамін D2 - 10000 МО/кг протягом 14 діб13Вміст гідропероксидів ліпідів Вміст Шиффових основ Глютатіонпероксидазна активність
Каталазна активність
Супероксиддисмутазна активність
Вміст води
Об`єм інулінового простору
Вміст кальцію
Гістологічні дослідження6Поєднане введення вітаміну D2 (10000 МО/кг) та вітаміну Е (50 мг/кг) протягом 14 діб11Вміст гідропероксидів ліпідів Вміст Шиффових основ
Вміст води
Об'єм інулінового простору
Вміст кальцію
7Поєднане введення вітаміну D2 (10000 МО/кг) та ніфедипіну (30 мг/кг) протягом 14 діб11Вміст гідропероксидів ліпідів
Вміст Шиффових основ
Вміст води
Об'єм інулінового простору
Вміст кальцію
8Поєднане введення вітаміну D2 (10000 МО/кг) та натрієвої солі етан-1-гідрокси-1,1-дифосфонової кислоти (130 мг/кг) протягом 14 діб11Вміст гідропероксидів ліпідів
Вміст Шиффових основ
Вміст води
Об'єм інулінового простору
Вміст кальцію

З метою моделювання ушкодження судинної стінки тваринам вводили високі дози вітаміну D у шлунок через зонд (0,125% олійний розчин з розрахунку 10000 МО/кг). Використана в роботі доза перевищувала добову потребу кролів у вітаміні D у 1000 разів і спричинювала розвиток підгострої інтоксикації.
Для з`ясування провідної ланки в механізмі ушкодження судинної стінки за умов D-вітамінної інтоксикації використовували поєднане введення препаратів:
1) вітаміну D2 (0,125% олійний розчин ергокальциферолу з розрахунку 10000 МО/кг у шлунок через зонд) та вітаміну Е (10% олійний розчин токоферолу ацетату з розрахунку 50мг/кг у шлунок через зонд);
2) вітаміну D2 (0,125% олійний розчин ергокальциферолу з розрахунку 10000 МО/кг у шлунок через зонд) та ніфедипіну ( з розрахунку 30мг/кг у шлунок через зонд);
3) вітаміну D2 (0,125% олійний розчин ергокальциферолу з розрахунку 10000 МО/кг у шлунок через зонд) та натрієвої солі етан-1-гідрокси-1,1-дифосфонової кислоти (ЕГДК) (з розрахунку 130мг/кг у шлунок через зонд за 2 години до введення ергокальциферолу).
Через 24 години після останнього введення препаратів тварин забивали за допомогою повітряної емболії й одразу проводили забір матеріалу для досліджень. Об'єктами вивчення були: грудна аорта, черевна аорта, легенева артерія й задня порожниста вена.
В роботі використано такі методики.

1. Визначення кількості гідропероксидів ліпідів
Принцип методу ґрунтується на тому, що в процесі ПОЛ у молекулах ліпідного субстрату, що окиснюється, утворюються спряжені подвійні зв'язки, які зумовлюють максимум у спектрі поглинання оптичного випромінювання при довжині хвилі 232 нм [17].
Ліпіди з тканин кровоносних судин виділяли за Fоlch і співав. [188]. Екстракцію ліпідів з отриманих у рідкому азоті гомогенатів проводили 17 об`ємами суміші хлороформ-метанол (2:1) - 10 хвилин при 40С. Екстракт фільтрували і тричі відмивали від неліпідних домішок 1/7 об`ємами води. Метанольну фазу екстрагували додатково хлороформом. Об`єднаний екстракт упарювали у вакуумі. Накопичення гідропероксидів у полієнових ліпідах оцінювали за характерним для дієнових кон`югатів УФ-спектром поглинання розчину ліпідів у метанол-гексані (5:1). Коефіцієнт молярної екстинції при максимальній довжині хвилі 232 нм приймався рівним 2,1?104 моль-1?см-1 [156]. Спектр поглинання ліпідів реєстрували на спектрофотометрі.

2. Визначення вмісту Шиффових основ
Шиффові основи - кінцеві продукти ПОЛ - утворюються при взаємодії коротколанцюгових діальдегідів з аміногрупами фосфоліпідів і реєструться за допомогою флюоресцентного аналізу. Вважається, що їх флюоресценція обумовлена 6?-електронною кон'югованою системою 1-аміно-3-імінопропенової групи, яка утворюється при біфункціональній реакції малонового діальдегіду з донорами аміногруп [17].
Шматки тканин гомогенізували в хлороформ-метанольній суміші 2:1. До отриманого гомогенату додавали рівний об'єм дистильованої води й інтенсивно збовтували. Суміш центрифугували, отриманий екстракт розводили метанолом 10:1 і проводили спектрофлюориметрію (максимум збудження флюоресценції - 360 нм, максимум випромінювання - 420-440 нм). Перед кожною серією вимірювань прилад калібрували за стандартним розчином сульфату хініну (1 мкг/мл в 0,1 н H2SO4) [176].

3. Визначення активності глютатіонпероксидази (КФ 1.11.1.9)
Глютатіонпероксидазну активність тканини визначали за методом Pinto і Bartley [232] в модифікації Кругликової Г.А. та Штутман Ц.М. [82]. Як окиснювальний субстрат використовували пероксид водню (Н2О2). Активність визначали в суміші такого складу: 2 мл гомогенату; 0,5 мл 0,25моль/л трис-буферу (рН=7,4); 0,1мл 0,025 моль/л ЕДТА; 0,1 мл 0,4 моль/л азиду натрію; 0,3 мл 0,05 моль/л відновленого глютатіону; 0,1 мл 0,05 моль/л