Вы здесь

Інтрогресії в геномі м'якої пшениці (Triticum aestivum L.) як фактор, що впливає на результати її генетичного аналізу

Автор: 
Вдовиченко Жанна Вікторівна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2004
Артикул:
0404U004071
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

<p>РОЗДІЛ 2<br />МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ<br />2.1. Рослинний матеріал<br />У дослiдженнях використовувалися: 1. Сорти м’якої пшеницi Аврора, Chines Spring<br />(AABBDD, 2n=42), 2. Геномно-замiщена форма Аврозис (AABBSlSl), створена Є.Г.<br />Жировим і Т.К. Терновською шляхом замiщення у сортi м’якої пшеницi Аврора<br />геному D геномом Sl вiд Aegilops sharonensis; 3. Нулі-тетрасомні лінії сорту<br />Chinese Spring за 4-ю гомеологічною групою (N4D-T4А, N4D-T4В, N4А-T4В,<br />N4В-T4D). В кожній такій лінії одна з хромосом відсутня (нулі-), а її гомеолог<br />з іншого геному представлено двома парами хромосом (тетра-). Нулі-тетрасомні<br />лінії створено Е.Сірсом [111] та люб’язно передано доктором Б.Гіллом академіку<br />О.О.Созінову. 4. Зразок виду Ae. longissima Schweinf. et Muschl. (SlSl).<br />5.Зразок виду T. boeoticum Boiss. (AbAb). 6. Гексаплоїдні інтрогресивні лiнiї<br />м’якої пшеницi iз генетичним матерiалом вiд Ae. sharonensis, одержані Т.К.<br />Терновською [9, 100] від схрещування сорту Аврора із геномно-заміщеною формою<br />Аврозис (171 лінія). 7. Гібриди F1, F2, F3 від схрещування ліній між собою та<br />із сортом Аврора, одержані в процесі виконання дисертаційної роботи. 8.<br />Беккроси до обох батьків для 16 комбінацій схрещування ліній із Авророю. <br />2.2. Методика гібридизації пшениці<br />Колосся материнських рослин емаскулювали пiнцетом, iзолювали пергаментними<br />пакетами та залишали до дозрiвання приймочок (на 3-4 днi). Запилення проводили<br />вручну. Якщо мiж цвiтiнням материнських i батькiвських рослин були значнi<br />промiжки в часi, колоски батьківських ліній із дозрілим пилком зберігали при<br />to=4oС. <br />2.3. Методика фенотипового оцiнювання<br />2.3.1. Методика електрофорезу білків.<br />Електрофорез b-amy проводили за модифікованою методикою Девіса [168] Для<br />проведення електрофорезу b-амiлази використовували сухi зерна. Їх подрiбнювали<br />за допомогою ступки Абіха i додавали 1 мл екстракцiйного буферу. Екстракцiю<br />проводили протягом ночi при температурi 4оС. <br />Склад екстракцiйного буферу<br />NaCl…………………………………….……..1,46 г<br />b-меркаптоетанол……………………………0,8 мл<br />H2O (дистильована)……………………….до 50 мл<br />бромфеноловий синій……….….декілька кристалів<br />Склад гелю<br />30% акриламiд………………………..…….13,2 мл<br />1% метиленбiсакриламiд……………………6,8 мл<br />TRIS………………………………………….100 мг<br />глiцин……………………….……………….480 мг<br />10% персульфат амонiю…………………....320 мкл<br />ТЕМЕД……………………………………….24 мкл<br />H2O (дистильована)………………………до 40 мл<br />Перед нанесенням проби центрифугували 5 хв. при 10 тис. об./хв. Наносили по 5<br />мкл екстракту в кожну слоту. <br />Склад електродного буферу<br />TRIS………………………………………....1,2 г<br />глiцин…………………………………………5 г<br />H2O (дистильована)…………………..….до 1 л<br />Проходження електрофорезу – від катоду до аноду. Параметри проведення<br />електрофорезу (на два скла): U = 299 V; I = 15 mA (протягом 30 хв.); I = 30 mA<br />(до кiнця проведення електрофорезу). Тривалість електрофорезу 3-3,5 год. <br />Після закінчення форезу скло витримували протягом однієї години в розчині<br />гідролізованого крохмалю такого складу: <br />крохмаль …………………………….……...30 г<br />CH3COONa (Na-ацетат)……………..….…...9 г<br />крижана оцтова кислота………………..…3 мл<br />H2O (дистильована)…………………..….до 1 л<br />Потім скло промивали водою та занурювали у розчин Люголя на 5-10 хв.:<br />KI………………………………………….….5 г<br />I2…………………………………………....2,6 г<br />60 % трихлороцтова кислота……………84 мл<br />H2O (дистильована)……………………..до 1 л<br />Гелі промивали проточною водою та висушували.<br />Електрофорез a-амілази. a-амілазу визначають у пророслому зерні (довжина<br />колеоптиле має бути 3-4 см). Подрібнений паросток заливають 1 мл екстрагуючого<br />буферу такого складу: <br />цукроза……………………………………..30 г<br />CaCl2…………………………………..……0,2 г<br />H2O (дистильована)………………....до 100 мл<br />бромфеноловий синій…….декілька кристалів<br />Склад гелю<br />30% акриламiд………………………..…….10 мл<br />1% метиленбiсакриламiд……………………8 мл<br />TRIS………………………………………….100 мг<br />глiцин……………………….……………….480 мг<br />сечовина………………………………………12 г<br />10% персульфат амонiю…………………....280 мкл<br />ТЕМЕД……………………………………….24 мкл<br />H2O (дистильована)………………………до 40 мл<br />Умови прведення форезу та склад барвників як для b-амiлази.<br />Електорфорез кислої фосфатази. Використовували ПААГ та екстракційний буфер<br />такого ж складу, як було описано для b-амiлази. Для аналiзу брали сухi зерна,<br />подрiбнювали їх ступкою Абіха та заливали 140 мкл екстракцiйного буферу.<br />Екстракцiю проводили протягом ночi при температурi 4о С. <br />Склад екстракцiйного буферу<br />TRIS………………………………………..300 мг<br />аскорбiнова к-та…………………………..350 мг<br />цистеїн-HCl……………………….………..35 мг<br />ЕДТА……………………………...………150 мг<br />цукроза………………………………..…….10 г<br />H2O (дистильована)…………………….до 50 мл<br />бромфеноловий синій……….декілька кристалів<br />Перед нанесенням проби центрифугували 5 хв. при 9 тис. об./хв. Вiдбирали по 30<br />мкл супернатанту кожної проби для аналiзу. Склад гелю та електродного буферу<br />використовували такий же, як і для електрофорезу b-амiлази. Проходження<br />електрофорезу – від катоду до аноду. Параметри проведення електрофорезу (на два<br />скла): U = 299 V; I = 15 mA (протягом 30 хв.); I = 30 mA (до кiнця проведення<br />електрофорезу). Тривалість електрофорезу 3-3,5 год. Після проходження<br />електрофорезу скло витримували у розчині для забарвлення гелів протягом 3<br />годин. <br />Розчин для забарвлення гелiв<br />0,2 М ацетатний буфер рН 5,0…..100 мл<br />1-нафтилфосфат (Na-сiль)……….50 мг<br />1 М MgCl2 * 6H2O…………….……1 мл<br />о-дiанiзидин…………………….…50 мг.<br />Реакцiю зупиняли 10% оцтовою кислотою.<br />Електорфорез зернової та листової естераз. Аналіз проводили за методикою [169].<br />Для електрофорезу зернової естерази зерна витримували двi доби на зволожених<br />фiльтрах, щоб вони наклюнулись. При аналiзi листової естерази рослини<br />витримували до стадії, коли довжина зеленого листя становила 3-7 см. Пiсля<br />цього рослинний матерiал подрiбнювали, додавали 200 мкл екстракційного буферу,<br />такого ж складу як наведено для аналізу кислої фосфатази, екстрагували нiч при<br />температурi 4оС. Склад ге</p>