Вы здесь

Антигенні та генетичні відмінності дисоціантів вірусів поліомієліту

Автор: 
Костенко Ірина Григорівна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2004
Артикул:
3404U004668
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали

2.1.1. Експериментальні тварини. У дослідах були використані виключно миші лінії BALB/c, які є найбільш адекватними для отримання гібридом. Загальна кількість тварин складала 60. Утримання тварин під час експерименту, мікроклімат, температура, вологість, світловий режим, об`єм повітря, тип клітин, тип підстилки відповідали загальноприйнятим нормативам утримання тварин, відповідно Європейської конвенції по захисту хребтових тварин, що використовуються з експериментальною метою. Експерименти проводили згідно з "Правилами проведення роботи з експериментальними тваринами". Тварини отримували стандартну дієту у вигляді гранульованого корму з періодичним додаванням вітамінних та білкових концентратів.
2.1.2. Віруси.
Для проведення досліджень були використані виробничі вакцинні штами вірусів поліомієліту І, ІІ та ІІІ типів, отримані з Інституту поліомієліту та вірусних енцефалітів ім. акад. М.П. Чумакова РАМН: штам LSc2ab (І тип), штам P-712ch2ab (ІІ тип), штам Leon12ab (ІІІ тип). Для кожного вірусу є паспорт. Всі віруси пройшли мінімальну кількість пасажів і культивувалися виключно при температурі 35оС.

2.1.3.Культури клітин.
При вірусологічних дослідженнях використовували перещеплювану культуру клітин HЕp-2 - клітини карциноми гортані людини. При одержані гібридом працювали з лімфоідною лінією Sp-2/0 - мієломні клітини мишей BALB/c, що втратили здатність до синтезу власних імуноглобулінів і дефектні по ферменту гіпоксантин-гуанін-фосфорібозілтрансферазі.

2.1.4. Середовища та реактиви.
Для гібридомної технології:
1. Середовища DMEM та H-Y "Sigma".
2. Ембріональна теляча сироватка та сироватка новонароджених телят "Hybry-Max "Sigma.
3. Деіонізована вода для культур клітин.
4. Селективні середовища HAT та НТ "Sigma".
5. ПЕГ 3200-3700, ПЕГ 1450 та ПЕГ 8000 "Sigma".
6. Натрія піруват "Sigma".
7. Антимишачий коньюгат до молекули IgG "Sigma".
8. Диметилсульфоксид "Sigma".
9. Повний ад'ювант Фрейнда "Sigma".
Крім того, користувалися різноманітним посудом для культур клітин: 24- та 96-лунковими стерильними планшетами, "матрасами", кріопробірками на 1 мл, центрифужними пробірками ємкістю 50 мл.
Для генетичних досліджень:
1.Набір для виділення нуклеїнових кислот "Рибо-сорб" ("АмпліСенс", Росія).
2. Набір для зворотної транскрипції РНК "Реверта-R-100" ("АмпліСенс", Росія).
3. Праймери, ферменти ("Литтех", Росія)
4. Набір для очищення ПЛР-фрагментів ("NucleoSpin", Німеччина)
5. Набір для сиквенсових реакцій "CEQ 2000" ("Backman", США).
2.1.5. Обладнання.
Для роботи з культурами клітин і гібридомами та отримання очищеного вірусного антигену використовували слідуюче основне обладнання.
1. Ламінарний бокс "Jouan".
2. СО2 - інкубатор "Jouan".
3. Деіонізатор "Barnsted".
4. Набір для стерилізації культуральних середовищ "Gelman Sciences".
5. Ультрацентрифугу УЦП1-75 та ротори РКС-50Т, РПУ-50Т.
6. Спектрофотометр СФ-46.
7. Холодильники на +4°С. -20°С і -70°С.
8. Інвертований мікроскоп "Биолам П-1
9.Дюари з рідким азотом для зберігання клітин.
Для одержання нуклеїнових кислот, їх очищення та секвенування було використано обладнання слідуючого порядку:
1. Ампліфікатор "Perkin Elmer" (США).
2. Настільна мікроцентрифуга "Eppendorf" (США).
3. Вортекс "Biolam" (Росія).
4. Термостат (25-100о С) для пробірок типу Eppendorf (Росія).
5. Холодильники на +4оС і на +20оС.
6. Камера для горизонтального електрофорезу "BioRad".
7. Транселюмінатор для проглядання гелей в ультрофіолетовому світлі.
8. Джерело струму для електрофорезу (блок постачання).
9. рН-метр.
10. Ваги електронні.
11. Секвенатор "CEQ 2000" ("Backman culture", США) з програмним забезпеченням.
Загальна методика досліджень базувалася на комплексному використанні вірусологічних, молекулярно-біологічних, біохімічних та математичних методів. Наукова робота включала ряд важливих етапів:
1. Приготування гелю-бентоніту.
2. Одержання очищених вірусних концентратів.
3. Селекцію дисоціантів ("бентонітових" варіантів) поліовірусів.
3. Імунізацію мишей лінії BALB/c вакциними штамами поліовірусів.
4. Одержання, первинний скринінг та клонування гібридом.
5. Аналіз гібридом та вивчення властивостей одержанних МКАТ, здатних диференціювати дисоціанти поліовірусів.
6. Виділення поліовірусної РНК кожного з бентонітових варіантів, синтез їх кДНК.
7. Секвенування окремих ділянок геному бентонітових варіантів поліовірусів.
8. Обробка результатів секвенування з використанням програмного забезпечення.

2.2. Одержання гелю бентоніту [167]
Сухий бентоніт (300 гр.) диспергували у трьох літрах деіонізованої води. Щоб перевести бентоніт у натрієву форму в суспензію додавали вуглекислого натрію до 1М концентрації. Суміш залишали на один день при кімнатній температурі. Після чого її кіп'ятили при помішуванні 1 час. Центрифугували 10 хвилин при 3000 об/хв., надосад зливали, а осад ресуспендували у літрі деіонізованої води у гомогенізаторі типу РТ-2. Далі центрифугували при 4000 об/хв. 20 хв. Найнижчу частину осаду, яка мала брудні часточки, видаляли. Останній осад трічі ресуспендували у літрі деіонізованої води, тривалість 20 хв. при 4000 об/хв. Відмитий бентоніт заливали трьома літрами води і струшували у шутель-апараті 3-4 години, далі суспензію центрифугували 5 хв. при 1000 об/хв. Осад, який містив грубі частки, видаляли. Надосадову рідину (дрібнодисперсну фракцію) центрифугували 40 хв. при 4000 об/хв. Осад, крім нижчої фракції, розводили у 0,14 М розчині хлористого натрію і знову осаджали, як на попередньому етапі. Фракціонування повторювали тричі, збільшуючи тривалість центрифугування і, видаляючи нижню частину осаду. Після цього бентоніт являв собою дрібнодисперсну фракцію, яку розводили деіонізованою водою до одержання 5% суспензії геля. Після стерилізації бентоніт можна використовувати для стерильних робіт.

2.3. Вірусологічні методи