Вы здесь

Одержання біологічно-активного пролактину людини із використанням бакуловірусної експресійної системи

Автор: 
Мелешко Руслан Анатолійович
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2005
Артикул:
0405U002740
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Методи технології рекомбінантних ДНК

2.1.1. Плазміди, бактеріальні штами, культура клітин комах. При конструюванні транспортних векторів використовували плазміди рМ1.2 [211], pFastBac, pFastBacHTa (GibcoBRL), pMelBac (Invitrogen) та штам E.coli DH10Bac (GibcoBRL), TG1 i DH5? (Invitrogen). Бактеріальні клітини вирощували на середовищі LB.
Як клітини-хазяїни для рекомбінантних вірусів використовували моношарові культури клітин комах Ap [211] Sf 9, Sf21, HF (Gibco BRL), які вирощували на середовищі ТС100 з додаванням 10% ембріональної сироватки теляти (Gibco BRL). Суспензійну культуру клітин HF вирощували на середовищі Express Five SFM (Gibco BRL) без додавання сироватки.
2.1.2. Отримання плазмідної ДНК. Плазмідну ДНК у препаративних кількостях виділяли, користуючись посібником [212] з деякими модифікаціями. 250 мл нічної культури центрифугували протягом 10 хв при 4-х тис. об/хв. Осад ресуспендували в 3 мл розчину трис-HCl 25 мM, pH7,4, EDTA 10 мM, цукрози 15%, лізоциму 2 мг /мл та інкубували протягом 20 хв на льодяній бані. Додавали 6 мл розчину NaOH 0,2M, SDS 1% і інкубували на льодяній бані протягом 10 хв. Додавали 7,5 мл розчину 3 М CH3COOK, pH 4,8 та інкубували на льодяній бані протягом 20 хв Додавали 50 мкл розчину РНКази А з концентрацією 1 мг /мл і інкубували протягом 20 хв при +37°С. Центрифугували 10 хв при 15 тис. об/хв (К24). Супернатант двічі екстрагували сумішшю фенол-хлороформ (1:1), один раз хлороформом і преципітували двома об'ємами етанолу. Осад розчиняли в 1.6 мл деіонізованої води, додавали 0.4 мл 0.4 M NaCl i 2 мл 13% поліетиленгліколю (молекулярна маса 6000), після чого інкубували протягом 60 хв при +4°С. Центрифугували 10 хв при 10 тис. об/хв при +4°С (К23). Осад промивали 70% розчином етанолу, висушували і розчиняли в 200-500 мкл деіонізованої води. 1-5 мкл відбирали для електрофоретичного аналізу.
2.1.3. Ферментна обробка і електрофорез ДНК. Рестрикційну переварку вірусної і плазмідної ДНК та лігування ДНК здійснювали за стандартною методикою, користуючись [212]. Використовували рестриктази, лігази і відповідні їм буферні розчини фірми Fermentas. Розділення фрагментів ДНК проводили за стандартною методикою [212], використовуючи 0,7% агарозний гель і трис-боратну буферну систему.
2.1.4. Ампліфікація фрагментів ДНК, очищення продуктів ампліфікації. Реакцію ампліфікації проводили користуючись термоциклером Perkin Elmer 9600 і набором реагентів фірми Roche. Нуклеотидну послідовність використаних в реакції праймерів наведено в розділі 3.1.
Продукти ампліфікаціїї виділялися із гелю за допомогою набору QIAEXII (Quiagen) відповідно до інструкції виробника.
2.1.5. Приготування компетентних клітин, трансформація їх плазмідною ДНК. Для приготування компетентних клітин використовували метод, описаний в [213]. 0,5 мл нічної культури E.coli вміщували в 50 мл середовища LВ з додаванням 10 мM MgSO4 і 0,2% глюкози та підрощували клітини до оптичної густини 0,3 при довжині хвилі 590 нм. Протягом 10 хв суспензію витримували на льодовій бані і збирали центрифугуванням при 3 тис об/хв протягом 10 хв. Осад ресуспендували в 0,5 мл охолодженого живильного середовища, до одержаної суспензії додавали 2,5 мл середовища LВ, доповненого 36% гліцерином, 12% поліетиленгліколем молекулярної маси 8000 і 12 мМ MgSO4. Суспензію клітин розділяли на аліквоти по 200 мкл і зберігали при -70°С.
Для трансформації плазмідною ДНК клітини розморожували на льодяній бані, відбирали 100 мкл суспензії і додавали до неї 1-5 мкл розчину ДНК з концентрацією 1-1000 мкг/мл. Інкубували 30 хв на льодяній бані, потім протягом 60 с піддавали температурному шоку при +42°С, після чого повертали суспензію на льодяну баню. Через 1-2 хв суспензію розводили в 10 разів LВ середовищем та інкубували протягом 1 години при +37°С, після чого розсівали на чашки з селективним антибіотиком.
2.2. Вірусологічні методи
2.2.1. Інфікування клітин комах. При моношаровому культивуванні сіяли 3х106 клітин на 25см2 матрац і інкубували, даючи клітинам можливість прикріпитися, протягом 1 години. Потім відбирали живильне середовище і покривали клітинний моношар 1 мл вірусного інокулюма, концентрація якого відповідала 0,1 - 10 БУО на клітину залежно від мети дослідження. Інкубували при +28°С протягом однієї години, відбирали інокулюм і заміщали його 5 мл свіжого живильного середовища. Інфіковані клітини інкубували при +28°С протягом 2-10 днів залежно від мети дослідження.
При суспензійному культивуванні клітини HF вирощували при +27оС в сухоповітряному термошейкері з похитуванням 100 кол/хв. Клітини інфікували з множинністю 1, коли культура досягала густини 2х106 клітин на 1 мл живильного середовища. Культуральну рідину з метою очищення розчиненого в ній rPRL відбирали на 48 годині після інфікування.
2.2.2. Трансфекція клітин комах вірусною ДНК. Трансфекцію проводили відповідно до посібника О'Рейлі [98] з деякими модифікаціями. Сіяли 0,8 х 106 клітин на 3 см чашку. Інкубували чашку при +27°С протягом однієї години, щоб дати можливість клітинам прикріпитися. Готували в стерильних епендорфах розчини: А - 1 мкг вірусної ДНК в 100 мкл живильного середовища з сироваткою без антибіотиків, В - 6 мкл ліпофектину (Gibco BRL) в 100 мкл живильного середовища з сироваткою без антибіотиків. Об'єднували обидва розчини, перемішували обережним суспендуванням, інкубували 45 хв при кімнатній температурі. Промивали клітини двічі середовищем без антибіотиків. До ДНК-ліпідного комплексу додавли 800 мкл ТС100 без антибіотиків, обережно перемішували. Відбирали середовище з клітинного шару і покривали клітини розбавленим ДНК-ліпідним комплексом. Інкубували при +28°С протягом 5 годин. Відбирали трансфекційну суміш і додавали 2 мл середовища з сироваткою і антибіотиками (пениціллін (50 мг/л) + стрептоміцин (50 мг/л)). Інкубували трансфіковані клітини протягом 72 годин.
2.2.3. Отримання вірусних бляшок. При отриманні бляшок керувалися посібником О'Р