Вы здесь

Ефективність фотодинамічної терапії пухлин з використанням 5-амінолевулінової кислоти (експериментальне дослідження)

Автор: 
Куценок Вадим Васильович
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2005
Артикул:
0405U003882
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

2.1. Характеристика експериментальних моделей
2.1.1. Злоякісні клітини, використані в експериментах in vitro
В роботі використані клітини асцитної лімфоми мишей NK/Ly (одержана в 1960 році шляхом перещеплення від миші С3Н зі спонтанним лімфолейкозом), клітини асцитного варіанту раку Ерліха мишей (одержана в 1932 році шляхом внутрішньочеревних перещеплень солідної аденокарциноми Ерліха), а також В-клітинна лінія лімфоцитів людини Namalwa (одержана в 1967 році від хворого лімфомою Беркіта).
Для культивування клітин Namalwa використовували такі живильні середовища: мінімальне середовище Ігла-МЕМ, а також середовище RPMI 1640. Середовища містили 2мМ L-глутаміну та NaHCO3 у відповідній кількості. До середовищ додавали також 10% сироватку ембріонів теляти (ЕТС) (Біомарк, Львів). При необхідності при культивуванні клітин використовували антибіотик гентаміцин (40 мкг/мл).
Клітини культивували при 37 0С в інкубаторі зі зволоженою атмосферою (100% вологості) з 5% СО2. Для субкультивування клітин використовували розчин Версену (Спофа, Чехія). Пухлинні клітини пересівали 1 раз на 3 доби у співвідношенні 1:2.
Клітини NK/ly і асцитного варіанту раку Ерліха перещеплювали мишам лінії BALB/c. Асцит від хворої тварини на 10 добу після попереднього перещеплення вводили внутрішньочеревно у кількості 0,2 мл мишам лінії BALB/c.
2.1.2. Піддослідні тварини
У роботі використані безпородні (б/п) й інбредні лабораторні миші ліній С57Bl/6, BALB/c розводки віварію Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України. Тварини мали нормальний габітус та були вільні від інфекційних захворювань. Використовували мишей обох статей віком 8-10 тижнів. Утримання мишей та робота з ними здійснювались у відповідності до міжнародно прийнятих правил проведення робіт з експериментальними тваринами. Досліди, які супроводжувались больовим синдромом проводили з використанням ефірного чи тіопенталового наркозу. Забій тварин проводили шляхом ефірного наркозу, або цервікальною дислокацією під ефірним наркозом. Всього у дослідах використано біля 870 мишей. Користуючись нагодою автор висловлює подяку працівникам віварію за допомогу у проведенні експериментів з використанням лабораторних тварин.

2.1.3. Штами перещеплюваних пухлин
Аналіз літератури показує, що на сьогоднішній момент дослідницькі групи використовують різні моделі пухлинного росту in vivo. В основному це клітинні культури мишачих і людських пухлин, перещеплені для експериментів мишам різних ліній або безтимусним мишам [9,10,164,165]. Для скринінгових досліджень ми вважали за доцільне використання моделей на основі перещеплюваних пухлин - метастазуючої епідермоїдної карциноми легенів Льюїс (3LL) і неметастазуючих пухлин - саркоми 180 (S-180) і солідного варіанту раку Ерліха (РЕ), штам якого підтримується в асцитному варіанті. Всі ці штами було отримано з лабораторії штамів ІЕПОР НАНУ. Автор висловлює подяку керівнику лабораторії с.н.с., к.б.н. О.Ю. Придатко.
Переваги даних моделей полягають у тім, що вони володіють практично 100% перещеплюваністю, високою швидкістю росту, чутливі до широкого спектру протипухлинних препаратів, і результати, отримані з їх застосуванням відрізняються високою відтворюваністю [166]. Використання зазначених пухлин дозволяє одержати локальні пухлинні вузли на визначений день росту пухлини, що є необхідною вимогою для проведення ФДТ.
Усі пухлини прищеплювали підшкірно на зовнішню поверхню стегна, де спостерігався локальний і рівномірний ріст пухлинних вузлів.
Штами мишей 3LL, РЕ, S-180 постійно підтримували пасажами на мишах лінії С57Bl/6, BALB/c та б/п, відповідно.
При дослідженні впливу ФДТ-АЛК на ріст і метастазування пухлин у якості основної експериментальної моделі використовувався штам 3LL. Пухлина виникла спонтанно у легенях миші С57Bl/6 у 1951 році і адаптована до трансплантації Lewis. За гістологічною будовою вона визначається як слабодиференційована епідермоїдна анапластична карцинома.
Штам саркоми 180. Пухлина виникла спонтанно у білої миші-самця у 1914 році в Крокеровському інституті у США. Спочатку була визначена як карцинома, у процесі перещеплення перетворилась у малодиференційовану саркому. Вона швидко росте та призводить тварин до загибелі через 4-5 тижнів після перещеплення.
Штам карциноми Ерліха був отриманий у 1905 році. Спочатку ця пухлина була перещеплюваною аденокарциномою, однак у даний час вона втратила свою тканьову специфічність і складається з недиференційованих клітин. Рак Ерліха існує у вигляді двох підштамів: підшкірного та асцитного. Асцитний штам отриманий у 1932 році Левенталем і Яном шляхом перещеплення підшкірного штаму у черевну порожнину, і у теперішній час він використовується у вигляді асцитного та підшкірного варіантів. Пухлина перещеплюється у 100% випадків, не піддається спонтанному розсмоктуванню. Латентний період після перещеплення триває 4-6 діб. Загибель тварин з підшкірним варіантом спостерігається на 12-20 добу.

2.1.4. Схема перещеплення пухлин

Усі штами були отримані з колекції штамів злоякісних пухлин банку ІЕПОР ім. Р.Є.Кавецького НАНУ. Карциному 3LL перещеплювали мишам лінії С57Bl/6 масою 18-20 г обох статей. Для цього готували суспензію пухлинної тканини. Мишей під ефірним наркозом забивали цервікальною дислокацією, в асептичних умовах вилущували пухлину і поміщали у чашку Петрі з розчином Хенксу. Видаляли ділянки пухлинної тканини, промивали їх у розчині Хенксу, ретельно подрібнювали і переносили у стерильний стакан. Отриманий гомогенат пухлини розводили 0,9% розчином натрію хлориду у відношенні 1:5. Для перещеплювання пухлини мишам вводили по 0,2 мл 20% суспензії пухлинної тканини підшкірно на зовнішній бік стегна тварини.
Саркому 180 перещеплювали безпородним мишам аналогічним шляхом.
Для перещеплювання раку Ерліха мишам лінії BALB/c вводили підшкірно на зовнішній б