Вы здесь

Роль тахікінінів в регуляції жовчоутворення

Автор: 
Співак Людмила Сергіївна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2005
Артикул:
0405U004007
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Початок експериментального вивчення функцій печінки пов'язують ще з ім'ям Теодора Шванна (19ст.). Велику роль у вивченні жовчоутворювальної функції печінки відіграли дослідження, проведені в лабораторії І.П.Павлова, де були успішно розроблені спеціальні методи гострих і хронічних експериментів, які дозволили вивчати жовчоутворення та його нейрогуморальну регуляцію. Як відомо, І.П.Павлов надавав великого значення методам фармакологічного аналізу, наголошуючи, що "химические вещества представляют собой тончайшие аналитические методы физиологии, так как при помощи химических агентов делят, изолируют то, чего нельзя разделить никакими инструментами" [25].
Визначені завдання дослідження вирішували за умов гострого досліду на щурах, в котрому враховували рівень холерезу і якісний склад жовчі, що вироблялась печінкою під впливом природних тахікінінів та селективних агоністів тахікінінових рецепторів. Дослідження проведені з використанням фізіологічних, хірургічних, фармакологічних та біохімічних методів наукового аналізу.
Експерименти проведені на 150 білих щурах масою 180-250 г. В дослід брали нелінійних щурів-самців, потомство одного виду, що дозволяло уникнути видових, вікових та статевих розбіжностей при трактуванні отриманих результатів. Всі піддослідні тварини знаходились на звичайному харчовому раціоні віварію, а перед дослідом голодували (18 годин) з вільним доступом до води. Дослід розпочинали з оперативного втручання, котре здійснювалось під тіопенталовим наркозом (5 мг/100 г маси тіла тварини, внутрішньочеревно). Наркотизованим щурам розтинали черевну стінку і у відпрепаровану загальну жовчну протоку вводили тонку канюлю, з'єднану поліетиленовою трубкою з мікропіпеткою, в яку збирали жовч. Щоб уникнути похибок в оцінці отриманих результатів, пов'язаних із впливом добового обмінного ритму на холерез, спроби проводились в один і той же час доби (1000-1500). Впродовж досліду збирали 6 півгодинних порцій жовчі, враховуючи її об'єм (в мікролітрах). В кожній відібраній пробі жовчі тонкошаровою хроматографією визначали концентрацію (в мг%) окремих жовчних кислот та ліпідних компонентів секрету.
Визначення жовчних кислот проводили за методикою, розробленою Весельським і співавторами [30]. Для цього 0,1 мл жовчі додавали до 1,8 мл охолодженої екстрагуючої суміші етанол-ацетон (1:3). Проби охолоджували впродовж 25-30 хвилин, після чого центрифугували 10-12 хвилин при 3000-4000 об/хв. Екстракт висушували при температурі 37-40?С до сухого залишку. Сухий залишок розчиняли у 50-100 мкл суміші етанол-вода (6:4). 5-10 мкл проби наносили на попередньо промиті і розмічені хроматографічні аркуші. Хроматографічний розподіл вільних і кон?югованих жовчних кислот здійснювали у суміші аміловий ефір оцтової кислоти - толуол - бутанол - оцтова кислота - вода (3:1:1:3:1) на платівках "Silufol". Жовчні кислоти ідентифікували за допомогою стандартів і різнокольорової флуоресценції в ультрафіолетовому діапазоні при активації сірчаною кислотою. Ця методика дозволила розділити суміш жовчних кислот у отриманій жовчі на такі фракції: таурохолева (ТХК), суміш таурохенодезоксихолевої і тауродезоксихолевої (ТХДХК+ТДХК), глікохолева (ГХК), суміш глікохенодезоксихолевої і глікодезоксихолевої (ГХДХК+ГДХК), холева (ХК), суміш хенодезоксихолевої ї дезоксихолевої (ХДХК+ДХК). Для кількісного визначення вмісту жовчних кислот хроматограми попередньо обприскували барвниками: 15 мл льодяної оцтової кислоти, 1г фосфорномоліденової кислоти, 1 мл сірчаної кислоти і 5 мл 50%-ного розчину трихлороцтової кислоти. Хроматограми проявляли при температурі 60-70?С вподовж 5 хвилин і визначали вміст жовчних кислот на денситометрі ДО-1М (при ?-620 нм).
В ліпідній фракції органічного складу жовчі визначали вміст фосфоліпідів (ФЛ), холестеролу (ХС), його ефірів (ЕХС), вільних жирних кислот (ВЖК) і тригліцеридів (ТГ) за запатентованою методикою Весельського та співавторів [26]. Отриману в дослідах жовч наносили на обеззолений фільтрувальний папір (по 50 мкл з проби) і залишали на 1,5-2 години для випаровування води. Досліджувану пробу у вигляді плями на папері подрібнювали ножицями на невеликі шматочки (2х3 мм2) і поміщали у пробірку з притертою пробкою. Загальні ліпіди екстрагували однофазною системою органічних розчинників хлороформ - ацетон - етанол (7:2:1) у співвідношенні до проби 20:1. В пробірку до подрібненої проби доливали 1 мл розчинника і впродовж 15 хв залишали у коливному апараті. Потім рідину зливали в точно зважену конусоподібну пробірку, а до проби ще два рази додавали по 0,5 мл суміші з 5-хвилинним інтервалом перебування в коливному апараті. Після випаровування розчинника екстракт аналізували за допомогою тонкошарової хроматографії на фабрично виготовлених пластинах "Silufol" розміром 15х15 см, попередньо активуючи їх впродовж 1 години в термостаті при 1100С. В цей же час в хроматографічну камеру, для кращого насичення, вносили фільтрувальний папір і наливали суміш розчинників: гексан - діетиловий ефір - оцтова кислота (7:23:1). Сухий залишок ліпідів розчиняли в 20 мкл хлорофомно - бензольно - ацетонової суміші (1:2:1) і наносили на розмічену хроматограму мікрошприцем. Після розподілу та видалення розчинника хроматограми фарбували 10%-ним розчином фосфорномолібденової кислоти в етанолі та ще вологими проявляли в термостаті при 1100С. Для кількісної оцінки ліпідів використовували денситометр ДО-1М та калібрувальні криві (за чистим холестеролом).
Для вирішення поставлених завдань в наших дослідженнях застосовувались тахікініни: субстанція Р, нейрокінін А, нейрокінін В та селективні агоністи NK1, NK2, NK3 тахікінінових рецепторів: метиловий ефір субстанції Р, фрагмент 4-10 нейрокініну А та сенктид (всі речовини виробництва "Sigma", США).
Вплив тахікінінів та селективних агоністів тахікінінових рецепторів на жовчоутворення та хімічний склад жовчі у щурів вивчали в двох серіях експериментальних досліджень.
В першій серії експериментів - 6-ти окремим групам щурів