Вы здесь

Патогенез токсичної нефропатії у щурів різного віку

Автор: 
Романів Людмила Вікторівна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2006
Артикул:
0406U001520
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1 Об'єкти досліджень
Відповідно до мети і задач дослідження в експеримент відбирали білих
безпородних щурів-самців з масою тіла від 40 до 470 г (в залежності від віку):
- у серії експериментів по вивченню особливостей водно-сольового обміну у
статевонезрілих інтактних щурів було використано 55 тварин у віці 5-7 тижнів;
- у серії експериментів по вивченню особливостей водно-сольового обміну у
статевозрілих інтактних щурів було використано 24 тварини у віці 3-3,5 місяці;
- у серії експериментів по вивченню особливостей водно-сольового обміну у
інтактних щурів старшої вікової групи було використано 25 тварин у віці 10-12
місяців;
- у серії експериментів по дослідженню параметрів водно-сольового обміну у
статевонезрілих щурів в умовах експериментальної нефропатії, викликаної солями
важких металів, було використано 24 тварини у серії досліджень із сулемовою
нефропатією;
- у серії експериментів по дослідженню параметрів водно-сольового обміну у
статевозрілих щурів в умовах експериментальної нефропатії, викликаної
дихлоридом ртуті, було використано 23 тварини ;
- у серії експериментів по дослідженню параметрів водно-сольового обміну у
щурів старшої вікової групи в умовах експериментальної нефропатії, викликаної
дихлоридом ртуті, було використано 23 тварини.
Вікові особливості діяльності нирок із сулемовою нефропатією вивчали через 7
діб після введення водного розчину дихлориду ртуті (сулеми). Водний розчин
сулеми вводили підшкірно, з розрахунку 0,4 мг на 100 г маси тіла. З моменту
введення до проведення навантаження тварини споживали стандартний раціон
харчування при вільному доступі до води.
2.2 Методи дослідження
Функцію нирок щурів вивчали в умовах індукованого діурезу. За 12 годин до
проведення функціональних проб твариною обмежували споживання їжі. Водне
навантаження робили з 800 до 830 щодня. Відстояну водопровідну воду вводили
внутрішньошлунковим зондом з розрахунку 5% від маси тіла. Сечу збирали протягом
наступних 2 годин.
Осмотичне навантаження також проводили ранком при обмеженні споживання їжі за
12 годин до навантаження. В якості навантаження використовували 3% розчин
хімічно чистого хлориду натрію (осмоляльність розчину складала 1050 мосмоль/кг
Н2О). Розчин хлориду натрію вводили внутрішньошлунковим зондом з розрахунку 5%
від маси тіла. Сечу збирали протягом наступних 2 годин.
Виведення тварин з експерименту здійснювали під легкою ефірною анестезією
шляхом декапітації. Зразки отриманої крові стабілізували гепарином. Цільну кров
не пізніше, ніж через 30 хв. центрифугували при 3000 об/хв, 15 хв. і відбирали
плазму для подальших досліджень.
В отриманих зразках проб сечі і плазми крові визначали наступні показники по
загальноприйнятих методиках.
Осмоляльність плазми і сечі вимірювали кріоскопічним методом на осмометрі 3D3
(вир-во США).
Креатинін плазми визначали фотометричним методом (л = 520 нм) за наступною
методикою (Рябов С.І. та ін., 1979):
- у центрифужну пробірку відбирали 0,5 мл проби плазми, додавали 2,5 мл
пікринової кислоти;
- центрифугували 15 хв. при 3000 об/хв.;
- відбирали 2 мл надосадової рідини в біохімічну пробірку, потім додавали 120
мкл 10% розчину NaOH;
- інкубували при кімнатній температурі 20 хв.;
- вимір проводили проти холостої проби, у яку помістили замість проби плазми
0,5 мл дистильованої води, у кюветі з довжиною оптичного ходу 10 мм.
Креатинін сечі визначали фотометрично (л = 520 нм) по реакції з пікриновою
кислотою (Рябов С.І. та ін., 1979):
- у колбочку об’ємом 25 мл поміщали 100 мкл проби сечі, додавали 500 мкл
пікринової кислоти і 500 мкл 10% розчину NaOH;
- інкубували при кімнатній температурі 15 хв.;
- доводили дистильованою водою до мітки;
- вимір проводили проти холостої проби в кюветі з довжиною оптичного ходу 10
мм.
Концентрацію нітритів плазми і сечі визначали фотометрично (л =540 нм) за
наступною методикою (Ємченко Н.Л. та ін., 1994):
- у центрифужну пробірку поміщали 0,25 мл 50% розчину сульфату цинку, 0,25 мл
17% розчину ферріціаніду заліза, 1 мл сечі ( плазми, води – для холостої
проби), додавали 0,5 мл боратного буфера (величина РН= 9,6) і 1 мл
дистильованої води;
- отриману суміш перемішували і центрифугували протягом 20 хв. при 3000 об/
хв.;
- відбирали 1 мл надосадової рідини в біохімічну пробірку, додавали 1 мл 3%
розчину оцтової кислоти, 1 мл дистильованої води і 1 мл 4% розчину реактиву
Гріса;
- вимір проти холостої проби проводили в кюветі з довжиною оптичного ходу 10
мм;
- калібрований графік будували за результатами фотометричного аналізу розчинів
нітриту натрію в діапазоні концентрацій від 0 до 100 мкмоль/л. Для приготування
розчинів використовували кристалічний нітрит натрію.
Концентрацію нітратів плазми і сечі визначали фотометрично (л =540 нм) за
наступною методикою (Ємченко Н.Л., 1994):
- у центрифужну пробірку поміщали 1 мл сечі (плазми, води – для холостої
проби), додавали 0,25 мл 50% розчину сульфату цинку, 0,25 мл 17% розчину
ферріціаніду заліза, 0,5 мл аміачно-хлоридного буфера (величина РН= 9,6) і 1 мл
дистильованої води;
- отриману суміш перемішували і центрифугували 20 хвилин при 3000 об/хв.;
- відбирали 2,5 мл надосадової рідини в колбу об’ємом 25 мл, додавали 1,25 мл
аміачно-хлоридного буфера, 1,25 мл дистильованої води, перемішували і
пропускали через стовпчик з губчатим кадмієм;
- елюат збирали в ту ж мірну колбу, додавали 2 мл 4% розчину реактиву Гріса,
доводили об’єм до мітки дистильованою водою і залишали на 10 хвилин;
- вимір проти холостої проби проводили в кюветі з довжиною оптичного ходу 10
мм;
- калібрований графік будували за результатами