Вы здесь

Ефективність ГАМК-похідних вітамінів в комплексному лікуванні регматогенного відшарування сітківки

Автор: 
Розанова Зоя Анатоліївна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2006
Артикул:
0406U001543
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ И КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объем исследований
Клинические исследования проведены у 109 больных, перенесших экстрасклеральное
пломбирование по поводу регматогенной отслойки сетчатки (109 глаз). Из них 62
больных составили группу, получавшую нейропротекторную терапию пикамилоном в
пред- и послеоперационном периоде, и 47 больных – группу сравнения.
Биохимические исследования субретинальной жидкости проводились 96 пациентам с
РОС. Рандомизацию проводили следующим способом: больные, пришедшие на
консультацию в профильный кабинет в среду попадали в группу получавшую
пикамилон, а из больных, пришедших на консультацию в другие дни недели
формировали группу сравнения.
Экспериментальные исследования in vitro проведены на 520 образцах изолированной
сетчатки крупного рогатого скота, в условиях in vivo на 80 неполовозрелых
самцах морских свинок, из них 40 составили опытную группу и 40 контрольную.
Таблица 2.1
Объем исследований
Вид исследования
Объект исследования
Объем исследования
Клинические исследования
больные основной группы
больные контрольной группы
всего больных
62 человек
47 человек
109 человек
Биохимические исследования СРЖ
больные основной группы
больные контрольной группы
всего больных
49 человек
47 человек
96 человек
Экспериментальные исследования
in vitro
in vivo
520 сетчаток
80 морских свинок
2.2. Методика экспериментальных исследований
В соответствии с целью и задачами настоящей работы, для дальнейшего применения
в клинике необходимо было отобрать препарат, который в наибольшей степени
проникает в отделы глаза, в частности, в сетчатку, особенно в условиях
гипоксии, при различных путях введения. Для этого использовали радиоизотопный
метод.
2.2.1. Методика постановки эксперимента на изолированной сетчатке.
В экспериментах in vitro исследовали скорость поглощения меченых препаратов
изолированной сетчаткой крупного рогатого скота местной породы. Глаза быков
получали на бойне, транспортировали при t° 0-4°С в сосуде Дьюара и брали в опыт
не позднее 2-х часов после забоя. Исследование проведено на 520 глазах. Вначале
вскрывали переднюю камеру и аспирировали водянистую влагу (ВВ), затем
изолировали сетчатку и круглым пробойником вырезали стандартные по площади
участки диаметром 15 мм, что составляло в среднем 8,5 мг сухой массы ткани.
Сетчатку погружали в инкубационную среду (ИС), которая состояла из 0,2 мл ВВ
(или 0,2 мл 0,15 М р-ра NaCl или 0,2 мл 0,15 М р-ра KCl) и 0,05 мл раствора
исследуемого меченого препарата в кюветах с крышками (рабочий объем 10 мл) и
инкубировали на водяной бане при t° 37°С в шуттель-аппарате в течение 2-32 мин
при изучении динамики поглощения (концентрация меченых препаратов была
постоянной и составляла 66 мкМ). При изучении кинетики транспорта, сетчатку
инкубировали в течение 4-х минут при концентрациях меченых препаратов от 33 мкМ
до 528 мкМ в тех же условиях. В каждом опыте параллельно исследовали ГАМК и
один из ГАМК-конъюгатов.
При исследовании динамики и кинетики в анаэробных условиях после помещения
меченых препаратов в кювету через ИС пропускали азот в течение 30 с, затем
герметично закрывали кювету крышкой. После инкубации сетчатку извлекали из
кюветы пинцетом и отмывали от не связавшегося меченого препарата погружением её
на 1с в физиологический раствор хлорида натрия (5 мл). В отдельных опытах
исследовали выход общей метки из отмытой сетчатки в 2,0 мл изотонического
раствора хлорида натрия или хлорида калия в течение первых 30 с (по 10 с в 3-х
кюветах последовательно) и последующих 10 мин.
Отмытую сетчатку помещали на предварительно взвешенные мишени из нержавеющей
стали, подщелачивали добавлением 0,1 мл 0,1 н р-ра NaOH. При исследовании
выхода метки из сетчатки на мишени также наносили по 0,1 мл промывных сред.
Мишени с сетчаткой высушивали при 90°С и взвешивали на аналитических весах,
таким образом получали сухой вес каждой высечки сетчатки. Подсчет
радиоактивности сухой сетчатки и инкубационных сред производили на
газопроточном счетчике 2154-1-1-М «ПРОТОКА», определяя число импульсов за 60 с
или 100 с. Затем делали пересчет на 10,0 мг сухого веса сетчатки и определяли
количество поглощенной из ИС общей метки. Рассчитывали также скорость
поглощения препаратов в наномолях/с на 1 г влажной ткани для сравнения с
таковой в срезах коры головного мозга.
2.2.2. Методика постановки эксперимента на лабораторных животных.
В экспериментах in vivo морским свинкам, самцам, весом 220-300 г исследуемые
меченые препараты вводили подкожно в дозе 50 мкмолей на 1кг, в 0,9 % растворе
хлорида натрия в объеме 0,5 мл на 100 г живого веса. Исследование проведено на
80 неполовозрелых самцах морских свинок. Часть животных помещали на 40 минут в
герметично закрытые сосуды ёмкостью 1066 мл (таким образом достигалась
гипоксия), контрольные животные 40 мин находились в открытом сосуде.
Исследования проводились в утренние часы.
Через 40 мин после инъекции животных забивали декапитацией, собирали кровь в
мерные пробирки с 5 мл 0,01 М NaOH, быстро извлекали головной мозг и глаза.
Глаза вскрывали отсечением переднего отдела, извлекали стекловидное тело,
сетчатку и сосудистую оболочку. Головной мозг препарировали и на исследование
брали стриарный и лобный отделы коры, а также гипофиз. Структуры глаза и
гипофиз помещали на предварительно взвешенные мишени вместе с 0,5 мл 0,01 М
NaOH, а из отделов мозга готовили гомогенаты на этом растворе в объёмном
соотношении 1:10 и наносили на мишень по 0,5 мл. Образцы высушивали при 90°С до
постоянного веса и определяли радиоактивность общей метки углерода-14