Вы здесь

Вплив радіаційних, термічних та хімічних чинників на різних стадіях онтогенезу на тривалість життя та біологічний вік Drosophila melanogaster

Автор: 
Кошель Наталія Михайлівна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2006
Артикул:
0406U001985
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ, ОБ`ЄКТ ТА МЕТОДИ дослідження
Дослiдження проводили на аутбредній лабораторній популяцiї Drosophila
melanogaster лiнiї Oregon-R. Розведення та утримання мух здійснювалось у
стандартних умовах: на повноцінному кормі, який містить на 100 мл води 4 г
цукру, 4 г манної крупи, 2,5 г дріжджів, 1 г агар-агару і 1 мл 10 %-го
спиртового розчину ніпагіну (для пригнічення росту цвілі) при температурі
(25±0,5) оС, режимі постійної вологості та освітлення (12 год світла - 12 год
темряви). У всіх експериментальних серіях пересадку на свіжий корм здійснювали
три рази на тиждень, одночасно проводили підрахунок померлих мух. Після повного
вимирання мух розраховували показники середньої ТЖ (СТЖ) і максимальної ТЖ
(МТЖ) (яку розраховували як СТЖ останніх 10 % мух, що вижили [42]). Опромінення
здійснювали на рентгенівській установцi “РУМ-17”. Співвідношення рентгена з
міжнародною одиницею: 1Р = 2,58 ґ 10-4 Кл/кг, оскільки 1 Гр = 100 Р, то 1 Гр =
2,58 ґ 10-2 Кл/кг.
2.1. В експериментальній серії, в якій досліджували вплив рентгенівського
опромінення на стадії яйця на параметри життєздатності та тривалість життя
імаго дрозофіли, опромінення здійснювали на стадії 75-хвилинного яйця дрозофіли
в 0,5 літрових банках (6 банок на варіант) при потужності дози 0,5 Гр/хв (U=200
kV; I=12,5 mA), у дозах 0.1, 0.3, 0.5, 1, 2 та 4 Гр. Діапазон доз підбирали у
попередніх експериментальних серіях таким чином, щоб рівень летальності комах
після опромінення максимальною дозою наближався до LD50.
Для визначення імагінальної ТЖ мух на третю добу після вильоту розсаджували в
пробірки висотою 150 мм і діаметром 15 мм, що вміщували по 2 мл корму, при
щільності популяції 30 особин на пробірку (самці та самки - окремо). Кожен з
варіантів експерименту включав по сім повторів. Після повного вимирання комах
розраховували імагінальну ТЖ.
Визначали параметри, що характеризують життєздатність мух: масу тіла;
інтенсивність метаболізму; локомоторну активність (фототаксис і геотаксис), а
також показники, що характеризують репродуктивну активність самок:
фекандильність та фертильність. Ті ж тести були проведені і для покоління F1.
Всі параметри життєздатності визначали у молодих імаго дрозофіли віком 5-7
діб.
Для визначення маси тіла (М) мух на торзійних терезах зважували по 300-800
самців та самок (6-12 повторів по 60-80 особин в кожному замірі) для кожного
варіанту дослідження; розраховували середню масу тіла однієї мухи (у мг).
Інтенсивність метаболізму (ІМ) оцінювали за допомогою CO2-аналізатора UG-51
ергоаналізатора Gerb Mijnhard (Голандія) по концентрації CO2 в суміші 1 мл
газу, що мухи (самці і самки - окремо), розсаджені в порожні герметично
закупорені пробірки (150 мм х 15 мм) по 60-80 особин, видихали протягом 260-300
хвилин. Всього по кожній групі заміри здійснювали у 16 пробірках (8 - з самцями
та 8 - з самками). Оскільки в різних експериментальних групах мухи мали різну
масу тіла і час перебування мух у герметично закупорених пробірках дещо
відрізнявся (у межах 1-3 хвилин), робили перерахунок показника ІМ за 1 хвилину
на 1 мг маси тіла мухи.
Для визначення локомоторної активності мух по 30 особин (самці та самки окремо)
вміщували в пробірки (200 мм ґ 20 мм), нижня частина яких знаходилася у муфті з
темної тканини 150 мм завдовжки. Легкими рухами мух струшували до низу
пробірки, яку при тестуванні на фототаксис (ФТ) розміщували горизонтально у
напрямку до джерела світла (лампи накалювання потужністю 100 Вт), а на
геотаксис (ГТ) - вертикально; за допомогою секундоміру реєстрували час (у
секундах), необхідний 50 % комах для виходу з-за краю муфти. Тестування у
кожній групі здійснювали у 15 повторах.
Для вивчення показників, що характеризують репродуктивну активність самок,
імаго у віці 5-7 діб розсаджували попарно (по 1 самиці та 1 самцю) в пробірки з
кормом на 24 години (всього по 30 пробірок у кожному варіанті). Визначали
фекандильніть (Фек) - кількість яєць, відкладених 1 самкою за добу, і
фертильність (Фер) - доля яєць від добової кладки 1 самки, що пройшли повний
цикл розвитку від яйця до імаго. В поколінні F1 ці показники визначали у самок
віком 12 діб.
2.2. В експериментальній серії, присвяченій вивченню реактивних змін
ультраструктури мозку імаго Drosophila melanogaster внаслідок іонізуючого
опромінення у ранньому онтогенезі, порівнювали зміни структур мозку комах,
викликані опроміненням на стадії яйця з такими при нормальному старінні. Самок
поміщали для кладки яєць по 200 - 220 осіб у 0,5-літрові банки (4 банки на
варіант) на 60 хв. Кількість відкладених яєць знаходилася в діапазоні 200-250
на банку (при більшій щільності популяції інтерпретація отриманих результатів
була б утруднена в зв'язку з можливим ефектом перенаселення - larval crowding).
Через 30 хв після закінчення яйцекладки банки з відкладеними яйцями
опромінювали у дозах 0,5 Гр і 4 Гр на установці РУМ-17, при потужності дози 0,5
Гр/хв (U=200 кV; I=10,2 mA). Таким чином, з урахуванням того, що в перші 30
хвилин після перенесення на свіжий корм самки відкладають тільки по декілька
яєць, вік більшості яєць у момент опромінення не перевищував 1 год.
Для електронномікроскопічного дослідження дрозофіл проколювали тонкою голкою в
області грудей і фіксували в 2,5 % розчині глютаральдегіда на фосфатному буфері
протягом 3-6 годин при температурі +4 °С. Після цього промивали у фосфатному
буфері (pH 7,4) протягом 2 годин і постфіксували в 1 % розчині тетраксида осмію
на фосфатному буфері (p 7,4) протягом 2 годин. Після зневоднення в спиртах і
ацетоні заливали в смолу епон-812. Ультратонкі зрізи голови дрозофіли (на
стадії імаго віком 12 та