Вы здесь

Функціональні реакції системи неспецифічного захисту та імунної системи при стресі за умов блокади опіатних рецепторів

Автор: 
Ушко Яна Анатоліївна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2006
Артикул:
0406U002408
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
матеріали та методи дослідження
2.1. Об’єкт дослідження
Дослідження функціонального стану нейтрофілів та імунної системи, а також
вивчення впливу опіоїдних пептидів на імунореактивність при розвитку стрес –
синдрому були проведені на 100 безпородних кролях, обох статей 5 – 7-и
місячного віку, вагою 3-4 кг.
Тварини утримувалися у спеціалізованому віварію з підтримкою необхідних
параметрів мікроклімату, використання збалансованого раціону харчування у
відповідності до нормативів утримання та розведення кролів в критих
приміщеннях.
Використання кролів як дослідних тварин дає можливість відбирати проби крові
для щоденних досліджень, і відповідно це дозволяє простежити динаміку
показника, що досліджується, при розвитку стрес-синдрому на одній тварині, що
підвищує достовірність статистичного аналізу даних.
Дослідження передбачає визначення морфологічних характеристик лізосомального
апарату нейтрофілів. Тільки у кролів лізосоми нейтрофілів ідентифікуються
методом світлової мікроскопії, що й забезпечує безпосередній візуальний
контроль за станом лізосомального апарату [169]. Крім того, для лізосомального
апарату нейтрофілів кролів визначені морфофункціональні показники “норми”, що
дозволяє порівнювати отримані дані із загальновизнаними показниками [169].
Постановка експериментів відповідала нормативам Конвенції з біоетики Ради
Європи (1997 року), Хельсинської декларації Всесвітньої Медичної Асоціації
(1996 року), Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які
використовуються для експериментальних та інших наукових цілей (Страсбург,
1985), загальним етичним принципам експериментів на тваринах, ухвалених Першим
національним конгресом України з біоетики (вересень 2001 року), іншим
міжнародним угодам та національному законодавству у цій галузі [256-259].
2.2. Схема експеримента
Стресовий стан моделювали за допомогою іммобілізації кролів у положенні на
спині впродовж дванадцяти годин [3; 260].
Кінетику пулу нейтрофілів визначали за допомогою підрахунку абсолютної їх
кількості у крові та показників, які характеризують гранулоцитопоез.
Функціональний стан лізосомального апарату нейтрофілів оцінювали за кількістю
лізосом та лізосомальних катіонних білків з наступним розрахунком таких
показників:
абсолютної кількості дегранульованих клітин;
ступеня та індексу декатіонізації;
ступеня та індексу дегрануляції.
Інтенсивність вивільнення лізосомальних ферментів нейтрофілів у кров’яне русло
оцінювали за активністю в сироватці крові їх маркера – кислої фосфатази.
Функціональний стан імунної системи визначали за такими показниками:
абсолютна кількість лімфоцитів;
абсолютна кількість Т- та В-лімфоцитів;
рівень сироваткових IgG, IgA, IgM;
рівень циркулюючих імунних комплексів (ЦІК);
гемолітична активність комплементу;
показники фагоцитозу нейтрофілів;
показники НСТ-тесту нейтрофілів
Вплив опіоїдних пептидів на функціональний стан нейтрофілів периферичної крові
та імунний статус організму вивчали шляхом моделювання блокади опіатних
рецепторів при стресі [9] з подальшим порівнянням одержаних показників за умов
наявності опіоїдних пептидів та блокади опіатних рецепторів. Також
розраховували коефіцієнти кореляції між показниками, які відображають
функціональну активність лізосомального апарату нейтрофілів та
імунореактивність організму.
Вивчення впливу ендогенних опіоїдних пептидів здійснювали шляхом блокади
опіатних рецепторів синтетичним антагоністом – налоксоном у дозі 0,4 мг/кг
(виробництво Харківське державне фамацевтичне підприємство “Здоров’я народу”,
Р. 01.99/00143. Налоксон-М 0,04% розчин по1мл. у ампулах). Препарат вводили
внутрішньом’язово у стегно за 15 хвилин до іммобілізації та кожні 6 годин
протягом всього експерименту.
Відповідно до наведених принципів загальної методики дослідження, тварини були
розподілені на дві групи: перша – контрольна – кролі підлягали тільки дії
стресора; друга – дослідна – дія стресора відтворювалась на фоні блокади
опіатних рецепторів.
Термін експерименту склав 14 діб. Спочатку визначали необхідні показники, потім
вводили налоксон, а через 15 хвилин кролі підлягали іммобілізації. Подальше
дослідження показників проводили на 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14 добу
експерименту. Така модель експерименту є загальноприйнятою [87] і відповідає
задачам дослідження. У дослідній групі вивчали вплив опіоїдних пептидів на
показники, які вивчалися.
Кров для дослідження (3-5 мл) брали із крайової вени вуха (vena auricula
marginala) вранці й натще. Перший забір крові проводили безпосередньо перед
уведенням налоксону. Подальший забір крові проводили у відповідну добу
експерименту у восьмій – пів на дев’яту годину ранку. Максимальну кількість
забору крові визначали експериментально з контролюванням гематологічних
показників.
Коефіцієнти кореляції розраховували за загальноприйнятою методикою [261].
2.3. Введення налоксону за умов іммобілізації кролів
Для досягнення поставленої мети нами був використаний синтетичний антагоніст
налоксон в дозі 0,4 мг/кг.
Налоксон належить до класу антагоністів опіатних рецепторів і використовується
в анестезіології та при розвитку шокових станів. Форма випуску препарату –
ампули по 1 мл 0,4% розчину для підшкірних, внутрішньом’язових та
внутрішньовенних ін’єкцій. Налоксон – “чистий” опіатний антагоніст
конкурентного типу. Механізм дії залежить від дози: в низьких дозах ефекти
препарату пов’язані з блокадою опіатних рецепторів, а у великих – він діє як
антагоніст кальцієвих каналів, та може виявляти невеликий агоністичний ефект.
При внутрішньовенному введенні діє швидко (через 1-3