Вы здесь

Епідеміологія вірусів зернових культур в агроценозах України

Автор: 
Снігур Галина Олександрівна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2006
Артикул:
0406U002627
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

Розділ 2. Матеріали та методи досліджень
2.1. Об‘єкти
2.1.1. Віруси
Об‘єктами досліджень були віруси зернових культур: вірус мозаїки бромусу (BMБ),
вірус штрихуватої мозаїки ячменю (BШМЯ) та грунтовий вірус мозаїки злакових
(ГВМЗ).
2.1.2. Рослини
В роботі використовувались рослини пшениці (Triticum aestivum) сорту
„Миронівська 65”, „Одеська 267” та „Донецька 48”, ячменю (Hordeum vulgare)
сорту „Екзотик”, жита (Secale cereale) сорту „Арфа”, лободи (Chenopodium
amaranticlor), тютюну (N. tabacum cv. Samsun., N. benthamiana), квасолі
(Phaseolus vulgaris) та насіння сортів, селекційних ліній та диких видів
злакових.
2.2. Матеріали та реактиви, які були використані в роботі
При виконанні роботи були використані наступні реактиви:
поліетиленгліколь 6000, уранілацетат, кумассі блакитний R-250, 1,2 –
фенілендиаміндигідрохлорид, N-n-нітрофенілфосфат, тритон X-100 (“Serva”,
Німеччина);
додецилсульфат натрію, 4-хлор-1-нафтол (“Merck”, Німеччина);
набір маркерних білків LMW (“Pharmacia”, Швеція);
повний ад’ювант Фрейнда, неповний ад’ювант Фрейнда (“Sigma”, США);
нітроцелюлозна мемебрана (“Schleicher and Schuell”, Німеччина);
гліцин, акриламід, біс-акриламід, понсо (“BDH”, Англія);
неорганічні компоненти буферних систем вітчизняного виробництва марок “хч” та
“чда”;
96-лункові планшети (“Labsystems”, Фінляндія);
антитіла проти імуноглобулінів кроля, кон’юговані з лужною фосфатазою;
Для ідентифікації вірусів зернових культур використовували стандартні
тест-системи („Loewe”, Німеччина) до вірусів:
вірус мозаїки бромусу (BMБ)
вірус смугастої мозаїки бромусу (BСМБ)
вірус жовтої карликовості ячменю (ВЖКЯ)
вірус карликовості пшениці (ВКП)
вірус штрихуватої мозаїки ячменю (BШМЯ)
вірус смугастої мозаїки пшениці (ВСМП)
вірус веретеновидної смугастої мозаїки пшениці (ВВСМП)
вірус м‘якої мозаїки ячменю (ВMМЯ)
вірус жовтої мозаїки ячменю (ВЖMЯ)
грунтовий вірус мозаїки пшениці (ГВМП)
грунтовий вірус мозаїки злакових (ГВМЗ)
Насіння зернових культур для тестування було любязно надане співробітниками
Центру генетичних ресурсів рослин України Інституту рослинництва ім. В.Я.
Юр‘єва (м. Харків) та селекціонерами інших науково-дослідних інститутів.
2.3. Методи досліджень
2.3.1. Відбір зразків
Дослідження проводили в Вінницькій, Дніпропетровській, Донецькій, Запорізькій,
Київській, Львівській, Одеській, Полтавській, Сумській, Харківській,
Херсонській, Хмельницькій, Черкаській та Чернігівській областях.
Метод виявлення та відбору рослинного матеріалу за зовнішніми симптомами
ураження є одним з найпростіших та найпоширеніших методів. Даний метод
базується на здатності багатьох вірусів злакових викликати на рослинах
характерні симптоми ураження, зокрема мозаїку, хлороз, деформацію, скручування,
смугастість, штрихуватість листкових пластинок, появу некрозів, вкорочення
стебел, надмірне кущіння, відставання в рості, карликовість та затримку
розвитку колосу.
Для ідентифікації вірусів зернових культур та дослідження їх розповсюдження і
біологічних характеристик відбирали зразки рослин пшениці, жита та ячменю в
трьох повторностях з трьох сталих точок в агроценозах 14 областей України та
вносили в стерильні пакети [175]. Зразки злакових відбирали за період з 2002 по
2005 роки.
2.3.2. Виділення та очищення вірусних препаратів
Виділення та очищення вірусу мозаїки бромусу проводили за різними методиками, з
метою порівняння концентрації вірусу, отримуваного в результаті очистки [4; 14;
172]. Як вірусвмісний матеріал використовували листя злакових культур з чітко
вираженими симтомами.
За методикою Wechmar (1968) листя Triticum aestivum через 10 днів після
інфікування гомогенізували в 0,3 М ацетатному буфері (рН 4,0). Після двох
циклів диференціального центрифугування осад ресуспендували в 0,03 М ацетатному
буфері (рН 4,0) [172].
За методикою Атабекова (1981) заморожене листя гомогенізували в 0,1М КН2РО4
(1:1 в/о). Гомогенат віджимали через тканину, віджатий сік підкисляли за
допомогою 1 н HCl до pH 4,6; інкубували 2 – 3 год. при кімнатній температурі та
цетрифугували при 6000 об/хв впродовж 25 хв. Надосад центрифугували при
80000-100000 g протягом 2-3 год. Осад ресуспендували в невеликому об‘ємі (до 10
мл) 0,1 М ацетатного буфера рН 5,5 та цетрифугували при 18000 об/хв 15 хв. Цикл
диференціального центрифугування повторювали кілька разів до отримання очищеної
суспензії вірусу [4].
За методикою Гнутової (1993) рослини Hordeum vulgare на 12 - 15-й день після
інфікування гомогенізували в 0,2 М ацетатному буфері рН 5,0, що містив 0,1 %
аскорбінової кислоти і 0,1 % МЕ. В гомогенат додавали 1/5 – 1/7 частину
хлороформу і гомогенізували не більше 2 хв. Вірус осаджували 7 % ПЕГ в
присутності 0,3 М NaCl. Після інкубації протягом години осад відділяли за
допомогою центрифугування при 6000 g 20 хв. Вірус ресуспендували в 0,5 М
ацетатному буфері рН 5,0 та проводили двократне диференціальне центрифугування
70000 - 90000 g протягом 1,5 год та 9000 - 18000 g протягом 20 хв [14].
Найбільш оптимальною для виділення вірусу мозаїки бромусу виявилась методика
Wechmar (1968) в нашій модифікації. Суть модифікації полягала в тому, що ми
змінили молярність і рН буферу. Зокрема листя гомогенізували в 0,5 М ацетатному
буфері, а осад після диференціального центрифугування ресуспендували в 0,05 М
(рН 5,5).
При дослідженні вірусвмісних препаратів концентрацію вірусу визначали
спектрофотометрично за формулою [43]:
C = A260 х N/Ke
де С-концентрація вірусу в мг/мл,
A260- екстинкція при довжині хвилі 260 нм,
N- розведення вірусного препарату,
Ke – коефіцієнт екстинкції [4].
2.3.3. Вивчення біологічних характеристик вірусів зернових культур
Біологічні властивості вірусів з