Вы здесь

Вплив бензимідазолу і його нових похідних на електричну активність нейронів Helix albescens Rossm. і поведінку щурів

Автор: 
Гамма Тетяна Вікторівна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2006
Артикул:
0406U003723
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РАЗДЕЛ 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Подготовка моллюска к эксперименту
В настоящей работе в качестве объекта исследования была выбрана нервная система
Helix albescens Rossm. Одним из основных аргументов выбора объекта было то, что
полученные на гигантских нейронах моллюска данные хорошо сопоставимы с
результатами исследований на нейронах других представителей животного мира и
характеризуют общие принципы функциональной организации механизмов,
обеспечивающих электрическую возбудимость соматической мембраны [53].
В весенне-летний период улиток собирали накануне эксперимента, а осенью
заготавливали и хранили в сухом, хорошо проветриваемом помещении при
температуре +10…+15 °°С).
За два-три дня до эксперимента отбирали необходимое количество улиток и
помещали в эксикатор, на дно которого помещали корм и наливали тонкий слой
воды. В качестве корма использовали морковь, поскольку в ней содержится большое
количество окрашивающих нейроны каротиноидов. Благодаря этой процедуре нейроны
были хорошо заметны под микроскопом [80].
При препарировании нервной системы в первую очередь, удалялась раковина улитки,
затем тело улитки фиксировалась к восковой пластине при помощи медицинских игл.
Острыми глазными хирургическими ножницами делался продольный разрез вдоль
затылочной складки. Используя иглы расширяли рану, перерезали ретракторную
мышцу и удаляли внутренние органы. После этой процедуры было заметно
окологлоточное нервное кольцо с отходящими от него нервами и коннективами.
Приподнимая препаровальной иглой поочередно все нервы, перерезали их как можно
дальше от ганглиев. После отсечения всех нервов окологлоточное нервное кольцо
быстро помещали в экспериментальную камеру (объем 0,5 мл) и жестко фиксировали
специальными крючочками к силиконовой резине, которой устлано дно
экспериментальной камеры. Жесткая фиксация обеспечивала стабильное длительное
внутриклеточное отведение потенциалов от нейронов, так как устраняла колебания
препарата потоком раствора. После макропрепарирования приступали к
микропрепарированию. При этом, под микроскопом МСПЭ-1 (рабочее расстояние с
объективом-апохроматом F=200 мм, увеличение 15х1,5) глазными ножницами для
разрезания синехии в соединительно-тканных оболочках исследуемого ганглия
делалось определенного размера окно, в результате чего отчетливо были видны
округлой формы тела нейронов. Через камеру со скоростью 1-2 мл/мин пропускали
раствор Рингера следующего ионного состава (в мМ/л): NaCl-100, CaCl2-10, KCl-4,
MgCl2-4, трис-HCl-10 (pH 7,5). При проведении экспериментов соблюдался
температурный режим +18…+22С°°.
Микроэлектроды из стеклянных трубочек с внутренним капилляром и наружным
диаметром 1,5 мм (стекло марки «Пирекс») изготавливали на полуавтомате марки
МЭ-4, заполняли 2,5 М раствором KCl и использовали на протяжении 24 часов. Для
эксперимента отбирали микроэлектроды с сопротивлением 10-30 МОм. В качестве
индифферентного электрода использовали вольфрамовую проволочку, которую
помещали в окружающий препарат раствор. Под визуальным контролем под
микроскопом МСПЭ-1 кончик микроэлектрода подводили к нейронам ганглия. С
помощью микроманипулятора контролировали позиции отводящего микроэлектрода.
2.2. Внеклеточная аппликация веществ
Бензимидазол и его производные, структурные формулы которых представлены ниже,
разводили в растворе Рингера того же состава, что омывал препарат в диапазоне
концентраций 10-6, 10-5, 10-4, 10-3 и 10-2 М. Количество однократно выводимых
из пипеток растворов веществ составляло один мл, что обеспечивало полную замену
раствора Рингера экспериментальной камеры на тестируемый раствор заданной
концентрации. Нерастворимые в растворе Рингера производные бензимидазола
переводили в хлориды.
2-бензилбензимидазол
2-этилтиобензимидазол
Бензимидазол
2-метилбензимидазол
2-этилбензимидазол
2-аминометилбензимидазол
2-(1-гидроксиэтил)бензимидазол
2-(3-гидроксипропил)бензимидазол
2-трифторметилбензимидазол
2-циклопропилбензимидазол
Соединения, использованные в нашей работе, были синтезированы на кафедре
органической химии Таврического национального университета им. В.И.
Вернадского. Как свидетельствовали данные элементного анализа, химическая
чистота соединений составляла не менее 95 %.
2.3. Внутриклеточное отведение биопотенциалов
После подведения микроэлектрода к выбранному нейрону с помощью
усовершенствованного микроманипулятора СЭЖ-3 производили прокол мембраны. О
проникновении кончика микроэлектрода через мембрану в цитоплазму судили по
внезапному появлению на экране осциллографа отрицательного МП и импульсных
разрядов в случае попадания в фоновоактивные нейроны. Идентифицировали нервные
клетки по визуальным (размер, цвет, положение в ганглии) и
электрофизиологическим (значения МП, тип спонтанной активности, параметры ПД,
наличию или отсутствию спонтанного синаптического притока и реакции на
поляризацию мембраны) признакам [80].
Исследование функционального состояния каждого отдельного нейрона под
воздействием конкретного вещества начинали в том случае, если его
электрофизиологические характеристики после момента внедрения микроэлектрода
оставались стабильными на протяжении 10-15 мин.
2.4. Аппаратурное обеспечение эксперимента.
Внутриклеточно отводимые биопотенциалы усиливали с помощью предусилителя
выносной головки (сопротивление обратной связи 1 ГОм) и усилителя нейронной
активности универсальной физиологической установки УФУ-БКН (полоса пропускания
0-10 кГц). Ввод сигналов в компьютер осуществляли с помощью 12-разрядног