Вы здесь

Електрофізіологічні показники нейронів виноградного равлика і поведінка щурів при дії деяких N-уроноілпохідних амінокислот

Автор: 
Раваєва Марина Юріївна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2006
Артикул:
0406U003724
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РАЗДЕЛ 2
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Метод внутриклеточного отведения биопотенциалов.
Эксперименты были проведены на нейронах дорзальной поверхности подглоточного
комплекса ганглиев улитки Helix albescens Rossm.
Влияние аминокислот и их производных было изучено на 341 идентифицированном и
261 неидентифицированном нейронах моллюска.
Препарирование нервной системы
Весь процесс препарирования складывался из двух этапов: макропрепарирования –
извлечение всей ганглионарной нервной системы из тела улитки и
микропрепарирование – снятие соединительнотканной оболочки с ганглиев.
При макропрепарировании, после удаления раковины, улитка фиксировалась к
восковой пластине при помощи швейных игл. Острыми глазными хирургическими
ножницами делался продольный разрез вдоль затылочной складки. Края раны
фиксировались к восковой пластине, окологлоточное нервное кольцо приподнималось
препаровальной иглой, удалялись внутренние органы и поочередно перерезали все
нервы. Изолированное окологлоточное нервное кольцо переносили в
экспериментальную проточную камеру (объем 0,5 мл) и фиксировали за нервы
вольфрамовыми крючочками к дну камеры, выстланной латексом. Через камеру,
объемом 0,5 мл, со скоростью 1мл/мин пропускали раствор Рингера следующего
ионного состава (в мМ/л): NaCl-100, CaCl2-10, KCl-4, MgCl2-4, трис-HCl-10 (pH
7,5) [60].
При микропрепарировании, специальным микрокрючком захватывались
соединительнотканные оболочки, которые срезались ножницами для вскрытия
сенехии.
При препарировании использовался бинокулярный микроскоп МБС – 9. Для освещения
использовался осветитель «Ломо», пучок света подавался сбоку, под углом 45o.
При проведении экспериментов соблюдался температурный режим +20…+22С°°.
Микроэлектроды
Исследование активности нейронов производилось с помощью жидкостных
микроэлектродов, заполненных 2,5 М раствором KCl, сопротивлением не менее 18
МОм. Микроэлектроды изготавливали из стеклянных трубочек (стекло марки
“Пирекс”) с внутренним капилляром на полуавтомате для вытягивания
микроэлектродов МЭ – 4. Диаметр трубочек составлял 1,4 – 1,5 мм. В качестве
индифферентного электрода использовали вольфрамовую проволочку, которую
опускали в окружающий препарат раствор.
Внеклеточная аппликация веществ
Перед аппликацией производные аминокислот, структурные формулы которых
представлены ниже, разводили в растворе Рингера того же состава, что омывал
препарат в диапазоне концентраций 10-6 – 10-2 М. Затем, при перекрытом протоке
раствора Рингера, с помощью пипетки раствор, в объеме 1 мл со скоростью 1
мл/мин, вводили в проточную камеру. Таким образом, происходила полная замена
раствора Рингера на тестируемый раствор определенной концентрации.
Внутриклеточное отведение биопотенциалов
После осуществления подготовки к эксперименту производили прокол мембраны
выбранного нейрона электродом, о введении которого судили по скачкообразному
отрицательному потенциалу на экране осциллографа.
Регистрацию фоновой электрической каждого отдельного нейрона начинали в случае
если его электрофизиологические характеристики оставались стабильными на
протяжении 10-15 мин.
Для отведения электрической активности в нейрон вводили один микроэлектрод,
который был связан с входным предусилителем, соединенным с усилителем нейронной
активности УФУ-БКН. За электрической активностью нейронов наблюдали с экрана
двуххлучевого осциллографа и с монитора компьютера. В качестве индифферентного
электрода использовали электрод от стимулятора ЭСЛ-2 с диодным мостиком 1 Ом -
1 кОм. Через индифферентный электрод подавался калибровочный сигнал с
амплитудой 75 мВ и длительностью 100 мс. Микроэлектроды были связаны с
электрической частью установки через солевой мостик и Ag-AgCl электрод.
Введение микроэлектродов в нейроны осуществляли под контролем
стереоскопического панкратического микроскопа МСПЭ – 1 с оптоволоконным
осветителем ОВС – 1.
Регистрация данных и обработка результатов
Сигнал с выхода усилителя тока поступал на каскад усиления с измененным
коэффициентом передачи (1–100), а далее – на однокаскадный активный фильтр
низких частот с программируемой частотой среза (0.5; 1; 2 и 3 кГц). С выхода
фильтра сигнал поступал на аналогово-цифровой преобразователь (АЦП), который
через интерфейс прямого доступа был подключен к памяти персональной ЭВМ.
Интерфейс прямого доступа к памяти управлялся с терминала компьютера. Режим
функционирования каналов регистрации токов, частота, амплитуда и другие
параметры контролировались компьютером. АЦП построен на базе 12 бит, 4-х
канального конвертера ADS7841 с последовательным синхронным интерфейсом,
программируемой точностью, понижаемой до 8 бит. Максимальная частота выборки –
200 кГц.
Помимо ADS7841 в устройстве использован микроконтроллер фирмы ATMEL, имеющий
RISC-архитектуру, который осуществляет интерфейс с персонального компьютера
(формирует и пересылает пакеты данных, настраивает АЦП на требуемый режим
работы). Прецизионный источник питания фирмы Texas Instruments обеспечивал
стабильную подачу опорного напряжения. Реализация АЦП в виде отдельного,
выносного устройства, подключаемого к последовательному порту персонального
компьютера, позволяла легко настраивать и использовать прибор на разных
машинах.
Программное обеспечение персонального компьютера разработано в нашей
лаборатории [33] при помощи Sybase Watcom C++ v11.0 для операционной системы
Windows (95, 98 2000 или NT). Программа позволяет производить непрерывную
запись медленных и спайковых потенциалов в течение заданного времени, с
возможнос