Вы здесь

Патогенетичні механізми взаємодії ліпополісахаридів бактерій з моноцитами і лімфоцитами крові людини in vitro

Автор: 
Косенко Юрій Валерійович
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2006
Артикул:
0406U004395
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы исследования
Объектом исследования были 120 культур моноцитов и 110 культур лимфоцитов
периферической крови практически здоровых доноров-мужчин в возрасте от 20 до 24
лет. Забор крови в объеме 20 мл проводили из локтевой вены в утреннее время
(7.00-8.00) до еды. Кровь вносили в стерильные стеклянные пробирки, содержавшие
0,2 мл гепарина, перемешивали и для получения плазмы отстаивали в течение 2
часов в термостате при 37єС. Полученную плазму крови в дальнейшем использовали
для выделения моноцитов и лимфоцитов.
Доноры, кровь которых использовали для проведения экспериментов, были тщательно
обследованы с целью исключения наличия острых и хронических инфекционных и
соматических заболеваний и стресса непосредственно перед забором крови [44]. У
всех доноров брали кровь для определения общего количества лейкоцитов и
процентного содержания моноцитов и лимфоцитов.
ЛПС грамотрицательных бактерий получали из культур микроорганизмов родов
Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophilus, Bacteroides, Prevotella,
Fusobacterium, выделенных от 120 больных хроническим генерализованным
пародонтитом средней степени тяжести, которые обращались за стоматологической
помощью в частную стоматологическую клинику «Улыбка» (г. Луганск, улица Фрунзе,
6) с января 2003 г. по сентябрь 2005 г.
Материал (экссудат из зубодесневых карманов) брали с помощью стерильных
бумажных штифтов, которые пропитывались экссудатом на 1 см своей длины, что
позволяло брать одинаковое количество экссудата. Штифт помещали в стерильную
пробирку и немедленно проводили вымывание экссудата 0,5 мл изотонического
раствора натрия хлорид, подогретого до 37?С. Посев для выявления анаэробной
микрофлоры производили немедленно в течение не более чем 2 часов с момента
забора материала на свежеприготовленный коммерческий агар с лошадиной
сывороткой и одним из антибиотиков (канамицин, гентамицин), а также на
обогащённую полужидкую тиогликолевую среду. Кроме того, материал засевали на
кровяной агар.
Для культивирования анаэробных неспорообразующих бактерий использовали
микроанаэростат, заполненный трёхкомпонентной газовой смесью (азот - 80 %,
водород - 10 %, углекислота - 10 %). Для выявления в нативном материале
бактерий рода Prevotella клинический материал просматривали в ультрафиолетовом
свете (люминесцентный микроскоп). Для идентификации анаэробных возбудителей на
четвёртом этапе лабораторного исследования (6-й-7-й день) использовали культуры
анаэробных бактерий, выросших на твердых и полужидких накопительных средах.
Исследуемые культуры идентифицировали до рода и вида по результатам изучения
культуральных, морфологических, тинкториальных, биохимических свойств и
чувствительности к антибиотикам.
Установление родовой принадлежности культур и видовую идентификацию бактерий
проводили по морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим
свойствам, а также по основным признакам патогенности согласно приказу
Министерства здравоохранения СССР № 535 от 22 апреля 1985 г. «Об унификации
микробиологических (бактериологических) методов исследования, которые
применяются в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических
учреждений» и “Определителя бактерий Берджи” [69]. Бактериологический анализ
бактероидов, фузобактерий и превотелл включал микроскопическое изучение
нативного патологического материала (окраска по Граму в модификации Копелова).
Идентификацию факультативно анаэробных бактерий проводили с использованием
коммерческих диагностических наборов «Энтеротест 24», «Нефермтест 16»,
«Колитест» производства фирмы Микро-ЛА-Тест, АО «Лахема», Чехия, приобретённых
в ООО «Донтест» (г. Донецк, улица Велозаводская, 119). Идентификацию строго
анаэробных бактерий проводили по биохимической активности с помощью
диагностического набора «Анаэротест 23» производства той же фирмы.
2.2. Методы исследования
Препараты ЛПС получали из клеточных стенок грамотрицательных условно-патогенных
бактерий водно-феноловой экстракцией при 65?С [58, 107, 134, 135, 137].
Очищение выполняли обработкой 50 нг/мл РНКазой (фирмы Sigma, США) и 16 нг/мл
ДНКазой (фирмы Sigma, США) с последующим диализом через 50 М трис-буфер и
центрифугированием при 20 000 g в течение 30 минут. Осадок сушили лиофильно.
Для восстановления активности ЛПС и их структурных компонентов применяли
редокс-обработку. Растворы ЛПС обрабатывали 2-меркаптоэтанолом с конечной
концентрацией 0,1 М в течение 18 часов при 4?С. Раствор хранили при -20?С.
Перед использованием раствор обрабатывали ультразвуком в водной бане в течение
5 минут. Использовали следующие рабочие концентрации ЛПС (мкг/мл): 10,0; 50,0;
100,0.
Популяции моноцитов и лимфоцитов периферической крови человека получали с
помощью центрифугирования на градиенте плотности фиколл-верографин 1,077 с
последующим лизисом эритроцитов ледяным раствором аммония хлорида. Цельную
кровь, разведенную в соотношении 1:1 средой 199, наслаивали на смесь
фиколла-верографина и центрифугировали 20 минут при 500 g. Снятые интерфазные
кольца мононуклеарных клеток дважды отмывали в течение 10 минут средой 199.
Затем ресуспендировали в полной питательной среде. Для подготовки суспензии
лимфоцитов в концентрации 2*109/л проводили расчет по формуле: В = (а/40-1)*с,
где а - количество лимфоцитов в камере Горяева; с - количество суспензии
клеток, оставленных в пробирке; В - количество фосфатно-буферного раствора,
которое необходимо добавить. Использование описанного метода позволяет выделять
из крови около 90 % лимфоцитов. Суправит