Вы здесь

Вплив структурних компонентів бактерій та глутаргіну на функціональну активність природних кілерів in vitro

Автор: 
Салманова Оксана Миколаївна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2007
Артикул:
0407U000455
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материал и методы исследования

Для реализации цели и задач исследования в течение 2000-2002 годов нами проведено бактериологическое обследование 89 больных (70 мужчин и 19 женщин) с хроническим травматическим остеомиелитом костей голени, протекавшим на фоне дефекта мягких тканей над костной полостью и выраженным склерозом костного ложа. Воспалительный процесс локализовался в 58 случаях в проксимальной трети (65,3 %), в 19 случаях (21,3 %) - в дистальной трети, в 6 случаях (6,7 %) - в средней трети и в 6 случаях (6,7 %) наблюдалось субтотальное повреждение большеберцовой кости. Все больные находились на лечении в Луганском областном остеомиелитическом центре Министерства здравоохранения Украины. Возраст больных колебался от 20 до 68 лет (средний возраст - 33,1?0,9 лет).
У всех больных во время оперативных вмешательств забирали патологический материал, помещали его в среду 199 и транспортировали в бактериологическую лабораторию кафедры микробиологии Луганского государственного медицинского университета. В лаборатории проводили выделение чистой культуры, используя для пересева агар Колумбия (производства фирмы Oxoid, США).
Выделение и идентификацию стафилококков проводили по морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам, а также по основным признакам патогенности согласно приказу Министерства здравоохранения СССР № 535 от 22 апреля 1985 г. "Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, которые применяются в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений". Для идентификации золотистых стафилококков (Staphylococcus aureus) использовали диагностический набор для бактериологических лабораторий "Стафитест-16" (производства фирмы Микро-ЛА-Тест, АО "Лахема"?, Чехия), приобретенный в фирме "Донтест" (г. Донецк, улица Велозаводская, дом 119).
Идентификацию палочек синего гноя (Pseudomonas aeruginosa) проводили с использованием диагностических наборов "Энтеротест 24 (стриппированный)", "Энтеротест 16 (стриппированный)" производства той же фирмы.
Пептидогликан получали из клеточной стенки золотистого стафилококка по методу Peterson P. K. и соавт. [171]. Культуры золотистого стафилококка выращивали в среде, которая содержала пептонный дрожжевой экстракт (0,5 % экстракт дрожжей, 1,3 ммоль К2НРО4, 1,1 ммоль глюкозы, рН=7,2-7,4) и инкубировали при 37?С на протяжении 2-4 часов. Бактерии логарифмической фазы инокулировали в 10 литрах вышеуказанной среды и инкубировали при 37?С на протяжении 24 часов со встряхиванием. Бактерии получали центрифугированием (5000 g, 4?С, 10 минут) и трижды отмывали холодной дистиллированной водой. Бактериальные клетки разрушали копром со стерильными стеклянными шариками диаметром 0,1 мм (фирмы Biospec Products, США). Копер использовали на протяжении 5 циклов по 90 секунд каждый. После седиментации шариков супернатант собирали и шарики трижды промывали. Супернатанты после промывки центрифугировали (14000 g, 4?С, 4 минуты), а потом выделяли белый верхний слой гранул, который содержал стенки бактериальных клеток. Клеточные стенки ресуспендировали в холодной дистиллированной воде и промывали. Для выявления интактных клеток бактерий использовали окраску по Граму. Клеточные стенки ресуспендировали в 2 % растворе натрия додецилсульфата и инкубировали в течение 12 часов. Материал дважды отмывали дистиллированной водой, а потом 0,05 М NaH2PO4 (рН=7,0) и 0,05 М трис-хлористоводородной кислотой (рН=7,5). Клеточные стенки ресуспендировали в 200 мл раствора 0,05 М трис-хлористоводородной кислоты, который содержал 5 ммоль магния хлорид, 5 мг/л ДНКазы (фирмы Sigma, США), 5 мг/л РНКазы (фирмы Sigma, США) и медленно встряхивали при 37?С на протяжении 1 часа. В конце добавляли 200 мг/л трипсина и смесь встряхивали еще 4 часа. После центрифугирования гранулы ресуспендировали в 50 мл дистиллированной воды, смешивали с 50 мл 80 % фенола и центрифугировали при комнатной температуре на протяжении 30 минут. После этого центрифугирования фракцию клеточных стенок тщательно собирали с поверхности, ресуспендировали в дистиллированной воде и трижды промывали в холодной дистиллированной воде. Затем фракцию ресуспендировали в 20 мл 10 % трихлоруксусной кислоты для удаления тейхоевых кислот и центрифугировали при 4?С 24 часа. Чистый пептидогликан был получен центрифугированием, после чего его ресуспендировали в 10 % трихлоруксусной кислоте и нагревали до 60?С в течение 90 минут для полного уничтожения тейхоевых кислот. Потом пептидогликан промывали 4-6 раз холодной дистиллированной водой, лиофилизировали и взвешивали на электронных весах. Использовали следующие его рабочие концентрации (мкг/л): 10,0; 50,0; 100,0.
Тейхоевые кислоты экстрагировали из клеточной стенки золотистого стафилококка 10 % трихлоруксусной кислотой [107]. Экстракт очищали с помощью колонки с ДЕАЕ-целюллозой и софадекса J-50. Изучение биологической активности тейхоевых кислот in vitro осуществляли при их концентрации в тест-среде 10,0; 50,0 и 100,0 мкг/л.
Препараты липополисахаридов получали из палочек синего гноя водно-феноловой экстракцией при 65?С [159]. Очищение выполняли обработкой 50 нг/мл РНКазой (фирмы Sigma, США) и 16 нг/мл ДНКазой (фирмы Sigma, США) с последующим диализом через 50 М трис-буфер и центрифугированием при 20 000 g в течение 30 минут. Осадок сушили лиофильно. Для восстановления активности липополисахаридов и их структурных компонентов применяли редокс-обработку. Растворы липополисахаридов обрабатывали 2-меркаптоэтанолом с конечной концентрацией 0,1 М в течение 18 часов при 4?С. Раствор хранили при -20?С. Перед использованием раствор обрабатывали ультразвуком в водной бане на протяжении 5 минут. Использовали следующие рабочие концентрации липополисахаридов (мкг/л): 10,0; 50,0 и 100,0.
Выделение естественных киллеров осуществляли по методу A. Boyum из периферической крови 15 практически здоровых мужчин и