Вы здесь

Надшвидке заморожування та відтавання ембріонів корів з використанням мембраностабілізуючих речовин

Автор: 
Яремчук Ірина Митодіївна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2007
Артикул:
3407U002391
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

2.1. Об'єкт і методи досліджень

Дослідження виконано в лабораторії біотехнології відтворення тварин Інституту біології тварин УААН, господарствах "Україна" Буського р-ну, "Правда" Бродівського р-ну Львівської області та Львівському науково-виробничому центрі "Західплемресурси".
В експериментах використані корови-донори та телиці-реципієнти української чорно-рябої молочної породи та голштинізованої худоби європейської селекції. Групи піддослідних тварин відбирали за принципом аналогів: за віком та живою масою. Усі тварини перед включенням у досліди підлягали загальному та ректальному обстеженню. При відборі враховували загальний стан здоров'я, вгодованість, вік та живу масу тварин. Використовували тільки тих тварин, які були визнані клінічно здоровими. В експериментах об'єктом дослідження були корови-донори різного віку та телиці-реципієнти віком 16-18 місяців, живою масою 360-380 кг. Годівля здійснювалась груповим методом згідно з раціонами, які використовувались у господарствах. Тварини утримувались прив'язно та безприв'язно і відповідно до цього за ними проводились спостереження, визначення строків проявів охоти, осіменіння. Вимивання ембріонів, їх пошук, морфологічна оцінка, підготовка до заморожування, кріоконсервування та пересадка ембріонів трансферабельних стадій розвитку телицям-реципієнтам проводились відповідно до запланованих дослідів. Загальна схема досліджень представлена на рисунку 1.
З метою відпрацювання методичних основ для експериментів з кріоконсервування ембріонів великої рогатої худоби нами були проведені дослідження на ембріонах лабораторних мишей. У дослідженнях
Рис. 1. Загальна схема досліджень
використовувались лабораторні миші лінії СWВА. З метою збільшення кількості доімплантаційних мишачих ембріонів, овуляцію стимулювали гонадотропінами: ГСЖК (гонадотропін сироватки жеребних кобил) і ХГ (хоріогонічний гонадотропін), вводячи їх самицям перед спаровуванням. У перший день вводили ГСЖК по 0,1 мл на кожну мишу, а на третій день вводили ХГ у дозі 0,2 мл. На ніч самок підсаджували до самців, а вранці перевіряли їх на наявність копулятивних пробок. День виявлення пробки вважали першим днем вагітності. На п'ятий день після спаровування проводили евтаназію самиць шляхом зміщенням шийних хребців і здійснювали вимивання ембріонів розчином Дюльбекко з відпрепарованих яйцепроводів. Вимиті ембріони декілька разів промивали у культуральному середовищі від механічного забруднення.
Об'єктом дослідження були ембріони на стадії морули та бластоцисти до і після кріоконсервування. Їх морфологічну оцінку здійснювали за допомогою бінокулярної лупи МБС-10 та мікроскопу МБС-15. Для кріоконсервування були використані інтактні, морфологічно повноцінні ембріони мишей і корів, вимиті хірургічним та нехірургічним методом від суперовульованих донорів.

2.2. Гормональна стимуляція множинної овуляції та штучне осіменіння корів-донорів

Перед початком обробки тварин попередньо піддавали гінекологічному обстеженню, досліджували яєчники на наявність чітко вираженого жовтого тіла. Сформоване жовте тіло в яєчнику служило основою для початку гормональної стимуляції суперовуляції у корів-донорів. Для індукції суперовуляції використовували схеми гормональної обробки корів-донорів із застосуванням дворазової синхронізації статевої охоти за допомогою синтетичного аналогу простагландину F2? (естрофан, ремофан) у дозі 500 мкг, який вводили двічі. Для викликання суперовуляції у корів-донорів використовували фолікулостимулюючий гормон (ФСГ) у дозі 40 мг, який розводили в 14 мл фізіологічного розчину і вводили внутрішньом'язово донорам (табл. 2.1).
Охоту корів-донорів встановлювали за чітко вираженим рефлексом нерухомості під час моціону. Гормонально оброблених тварин двічі осіменяли ректо-цервікальним способом після виявлення статевої охоти - вранці і ввечері (або навпаки), з інтервалом 10-12 годин. В одній дозі сперми, яку вводили в тіло матки, було не менше 30 млн. активних сперміїв з прямолінійно-поступальним рухом.
Таблиця 2.1
Схема гормональної обробки корів-донорів
День естрального циклуНазва препарату, процесКількість введеного ФСГ
Загальна доза
8:00
20:0010ФСГ-п8 мг7 мг15 мг11ФСГ-п6 мг5 мг11 мг12ФСГ-п5 мг4 мг9 мг12естрофан250 мкг250 мкг500 мкг13ФСГ-п3 мг2 мг5 мг14статева охота і штучне осіменіння15штучне осіменіння21нехірургічне вимивання ембріонів
2.3. Вимивання ембріонів корів-донорів

На 7-8-й день статевого циклу проводили вимивання ембріонів із маткових рогів корів-донорів. Тварину фіксували у станку, звільняли пряму кишку від калових мас, оцінювали стан статевих органів, визначали кількість жовтих тіл на кожному яєчнику та наявність неовульованих фолікулів. Позитивною на введення ФСГ вважали реакцію яєчника при наявності не менше трьох жовтих тіл. Зовнішні статеві органи корів-донорів й оточуючу їх ділянку обробляли теплою водою з милом і дезінфікували. Для часткового знерухомлення тварин вводили препарати ксилазину: рометар (Чехія), седазин (Польща) в дозі 0,1 мл на 100 кг живої маси внутрішньовенно. З метою знеболення органів тазової порожнини та зняття напруження прямої кишки проводили сакральну епідуральну анестезію введенням 5 мл 2 % розчину новокаїну між останнім крижовим і першим хвостовим хребцями. Вимивання здійснювали шляхом введення у матку двоканального катетера, балончик якого розміщували за біфуркацією. Перед введенням катетера, його зрошували препаратом "Керолан" ( Чехія). На промивання одного рога використовували 0,5 л середовища Дюльбекко з 2 % вмістом фетальної сироватки та гентаміцином.

2.4. Пошук та морфологічна оцінка ембріонів

Після 30-ти хвилинної седиментації вимивної рідини проводили пошук ембріонів та їх оцінку за допомогою мікроскопа МБС-15. Знайдені у вимивному середовищі ембріони переносили за допомогою капілярів аб