Вы здесь

Селективно культивовані гемопоетичні стовбурові клітини у корекції експериментального променевого імунодефіциту.

Автор: 
Сколожабський Андрій Анатолійович
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2007
Артикул:
0407U002419
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
Вирішення сформульованих завдань здійснювалося шляхом проведення дослідів in vitro та in vivo. У дослідах in vivo вивчали корекційний вплив ізо- та ксеногенних ГСК, які були отримані з кістково-мозкового джерела щурів за технологією селективного (вибіркового) культивування in vitro, на променевий імунодефіцит після їхнього введення експериментальним тваринам.
У дослідах in vitro для одержання культури ГСК плюрипотентного класу використовувався червоний кістковий мозок стегнових кісток статевозрілих щурів-самців лінії Wistar-Kyoto масою 400 - 450 г у кількості 20 особин, що втримувалися на брикетованих кормах за умов віварію.
Суспензію клітин кісткового мозку виділяли відразу після декапітації під пентобарбiталовим наркозом із використанням внутрішньочеревного введення 40 мг/кг пентобарбiталу натрію. У стерильних умовах видаляли епіфізи стегнових кісток, а діафізи промивали 0,5 мл живильного середовища MEM із додаванням 20 % сироватки крові ембріонів корів за допомогою голки 16 G, насадженої на шприц. Отриманий змив первинного клітинного матеріалу КМ щурів висівали на пластикові чашки Петрі (Sarstedt, Німеччина) і стерильні
6-лункові пластикові планшети та вирощували на 2 % агар-агаровому (агар-агар мікробіологічний, ЗАТ "Хімреактив", Росія, Н.Новгород) матриксі при температурі 37,0 ± 0,2 °С (термостат електричний сухоповітряний ТС-80, Росія) протягом шести тижнів після експлантації з використанням селективного живильного середовища (СЖС). Культивування здійснювалося за природних параметрів газоповітряного середовища й вологості та з додаванням 10 % сироватки ембріона теляти (ТОВ "Біолот", Росія).
За основу рецептури СЖС покладено стандартний живильний розчин для культивування клітин MEM (Life Technologies Inc., Італія) [188, с. 225-228], у якому було змінено якісний склад рецептури та масові концентрації деяких складових, що обумовило його вибіркову функцію.

СЖС конструювалося на основі стерильного фосфатно-сольового буферного розчину Хенкса з pH 7,4 (ТОВ "Біолот", Росія) з індикаторним барвником феноловим червоним, що змінював забарвлення з яскраво-червоного (у свіжому середовищі) до жовто-жовтогарячого (у середовищі з культивованими протягом деякого часу клітинами).
Стерильність культури протягом усього терміну культивування забезпечувалася сумісним використанням тіазолвмісних сполук та препаратів із групи аміноглікозидів. Використовували реактиви та матеріали для культивування клітин виробництва ТОВ "Біолот", Росія.
Для одержання даних про посадкову концентрацію клітинного матеріалу після дезагрегації тканини кісткового мозку щурів були відібрані шість порцій клітинного аспірату по 1 мл кожна. Кожна порція вносилася в градуйовані конусні центрифужні пробірки з 3 мл живильного розчину MEM без сироватки й тричі піддавалася центрифугуванню при 1000 об/хв. протягом 5 хв.
Після кожного центрифугування провадили відбір надосадової рідини зі збереженням 1 мл її залишкового об'єму, а осад ресуспендували механічним зняттям клітин скляною паличкою з гумовим наконечником і додаванням свіжого живильного розчину МЕМ без сироватки в об'ємі 3 мл. Після останньої процедури центрифугування, відбору надосадової рідини й механічного ресуспендування клітини отриманої суспензії (1 мл) підраховувалися в лічильній камері Горяєва за стандартною методикою.
Ферментна дисоціація клітин досягалася шляхом промивання моношару фосфатним сольовим буфером (ФСБ) або ФСБ с 1 мМ ЕДТА та наступною інкубацією з холодним розчином трипсину (0,25 % неочищений або 0,01 % - 0,05 % очищений) протягом 30 с, з подальшим його видаленням. Клітини потім додатково інкубували протягом 15 хв. та суспендували в живильному розчині.
Для механічного збору клітин використовували спеціальні шкребки з гумовими наконечниками, що випускаються фірмою Мac-Farlane Robson Ltd. (Великобританія). Ці гумові наконечники одягали на кінчик скляної палички, утворюючи м'яку поверхню. За допомогою скляної палички клітини відскрібали із субстрату. Для знімання клітин із поверхні матриксу чашок Петрі та 6-лункових планшетів використовували також клинчики із силіконової гуми, що вирізали з корка та одягали на кінчик ін'єкційної голки. Стерилізацію шкребків та клинчиків здійснювали автоклавуванням.
Густину насищення клітинами моношару (Кл/см2) у дослідах визначали з використанням стандартного стерильного боксованого планшету (мал. 2.1, спільне виробництво фірми "Біолаб ЛТД", Росія та Greiner Bio-One GmbH, Австрія).

Мал. 2.1. Планшет культуральний 6-лунковий, плоскодонний (9,6 см2 та 16,5 мл/лунку), полістироловий, із кришкою, стерильний (Greiner bio-one), зі спеціальною обробкою внутрішньої поверхні фібонектином (Fibronectin), стандартних габаритних розмірів (A = 127,8±0,2 мм; B = 85,5±0,2 мм;
C = 19,0±0,15 мм; D = 35,58 мм; D` = 35,0 мм; E = 13,2 мм; F = 16,5 мм;
G = 23,25 мм; H = 24,9 мм; I = 39,0 мм).
Після дисоціації (ферментної, за допомогою 0,01 % розчину трипсину, або механічної) клітин отриману клітинну суспензію тричі відмивали центрифугуванням і ресуспендували у свіжому живильному розчині MEM без сироватки, як зазначено раніше, потім оцінювали стан клітинної культури, тобто підраховували загальну кількість клітин, а також виявляли в їхньому числі мертві й живі клітини (0,1 % розчин барвника трипанового синього забарвлював тільки мертві клітини). Однорідність клітинної суспензії за кількістю клітин на одиницю об'єму досягали використанням магнітної мішалки ММ-01 лабораторної (Гомель, Білорусь). Підрахунок клітин виконували за допомогою лічильної камери Горяєва за стандартною методикою [189-192].
Мазки із клітинним матеріалом готували на предметних стеклах за такою методикою: предметне скло втримували на столі або в лівій руці за краї. Правою рукою приставляли шліфоване скло вузьким краєм до предметного скла із суспензією клітин ліворуч від краплі, сорозмірної із предметним склом, та під кутом 45° із легким натиском просували вправо до зіткнення і