Вы здесь

Люмінесцентне визначення деяких біологічно активних речовин за допомогою комплексів лантанідів з похідними оксохінолін-3-карбонової кислоти

Автор: 
Скрипинець Юлія Володимирівна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2007
Артикул:
3407U002669
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РАЗДЕЛ II
РЕАКТИВЫ И АППАРАТУРА
Исходные вещества, приготовление растворов
В работе использовали реактивы квалификации не ниже ч.д.а. и бидистиллированную
воду.
Стандартные растворы хлоридов тербия, диспрозия, европия и самария (0,1 моль/л)
готовили растворением соответствующих оксидов высокой чистоты, которые
предварительно прокаливали в муфельной печи в течение 1 часа при 650-700єС, в
хлористоводородной кислоте (1:1) с последующим выпариванием ее избытка на
водяной бане. Сухой остаток растворяли в дистиллированной воде и разбавляли до
необходимого объема. Концентрацию полученных растворов РЗЭ контролировали
комплексонометрически с индикатором арсеназо I в уротропиновом буферном
растворе при рН 7.0 ± 0.2.
Использованные реагенты, производные 2-оксо-4-гидроксихинолин–3 карбоновой
кислоты, были синтезированы, идентифицированы и очищены в Национальном
фармацевтическом университете (г. Харьков) [[ccxiii], [ccxiv]]. Растворы
(1Ч10-3 моль/л) реагентов L1-14 получали растворением их точных навесок в воде,
растворы (1Ч10-3 моль/л; 1 мг/мл) реагентов L15-17 получали растворением точных
навесок в диметилформамиде (ДМФА). Рабочие растворы реагентов готовили
соответствующим разбавлением водой.
Исходные растворы норфлоксацина и дифлоксацина (1Ч10-3 моль/л)
(Riedel-de-Haen, Seelze) готовили растворением точных навесок в воде с
подщелачиванием 0,1 моль/л раствором NaOH до рН 7.5 и хранили при температуре
4°С. Рабочие растворы готовили соответствующим разбавлением водой.
Исходные (0,1 мкг/мл) растворы высокополимерных двуспиральных ДНК: спермы
сельди (сс ДНК), тимуса теленка (ттДНК), спермы лосося (слДНК) (Sigma
Steinheim, Germany) готовили растворением точных навесок в воде и хранили при
температуре 4 °С. Исходный раствор односпиральной ДНК (ос-ДНК) (900 мкг/мл)
готовили растворением ос-ДНК (5’-GGG GAA CCA AAT CCT TAT TGA AAT GTG CGT-3’)
(Metabion international AG, Martinsried, Germany) в воде и хранили при
температуре 4°С.
Раствор пероксида водорода (1Ч10-2 моль/л) готовили из 3%-ного водного
раствора, стандартизованного титриметрически.
Исходные растворы 1U/мл щелочной фосфатазы (ЩФ), выделенной из слизистой
оболочки кишечника быка (Sigma), 1Ч10-3 моль/л фенилфосфата натрия (ФФ) и
1Ч10-2 моль/л хлорида магния готовили растворением точных навесок в воде.
Рабочие растворы ЩФ готовили разбавлением исходного раствора водой.
Растворы (1Ч10-2 моль/л) поверхностно-активных веществ готовили растворением
точных навесок в воде.
Значение рН растворов устанавливали с помощью:
1) 2,86 моль/л (40%-ного) водного раствора уротропина, который готовили
растворением 200,0 г уротропина в воде, с последующим подкислением с помощью
раствора соляной кислоты до рН 7,5 и доведением полученного раствора
дистиллированной водой до объема 500 мл.
2) Трис-HCl буферного раствора 0,1 моль/л, который готовили растворением
Трис-основания (1,211 г) («Merck») в 90 мл воды, с последующим добавлением 0,1
моль/л HCl до pH 8,0, 9,0 и разбавлением растворов до 100 мл водой.
3) буферного раствора (1Ч10-2 моль/л)
3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты (MOПС) (Sigma); буферный раствор
готовили растворением 2,093 г MOPS в 900 мл воды с последующим добавлением 0,1
моль/л раствора NaOH до рН 7,4 и разбавлением раствора до 1000 мл водой.
Стандартный раствор хинина сульфата (1Ч10-2 моль/л) (Fluka) готовили
растворением точной навески в 1 моль/л H2SO4.
Стандартный раствор (1Ч10-2 моль/л) комплекса рутения
[Ru (2,2/ - дипиридил)3]Сl2 Ч 6 Н2О («Fluka») готовили растворением точной
навески в воде.
Аппаратура и оборудование
Спектры люминесценции и возбуждения, а также кривые затухания люминесценции
регистрировали с помощью спектрофлуориметров: ИСП-51 с ртутно-кварцевой лампой
СВД-120А, Aminco-Bowman Series 2
(SLM – Aminco, Rochester, NY) с двойным источником света (ксеноновая лампа
150-W), СМ2203 «SOLAR» (Беларусь) с ксеноновой лампой 150-W. Все измерения
проводили при комнатной температуре (21-23°С). Спектры люминесценции ионов
европия (III) регистрировали в области 560 - 650 нм с лмакс = 580, 590 и 612 нм
(переходы 5D0 ®7F0, 5D0 ®7F1 и 5D0 ®7F2 соответственно); самария (III) –520 -
670 нм с лмакс = 562, 595 и 640 нм (переходы 4G5/2 ®6H5/2, 4G5/2 ®4H7/2, и
4G5/2 ®6H9/2, соответственно); тербия (III) – 480 - 620 нм с лмакс = 490, 545 и
590 нм (переходы 5D4 ®7F6, 5D4 ®7F5, 5D4 ®7F4 соответственно); диспрозия (III)
– 460 - 595 нм с лмакс = 480, 577 нм (переход 4F9/2 ®6Н13/2, 4F9/2 ®6Н11/2
соответственно).
Измерение люминесценции с временным разрешением проводили в черных плоскодонных
96 - луночных микропланшетах из полистирола (Greiner Bio-One GmbH,
Frickenhausen, Germany) на спектрофлуориметре - Genios Plus (Tecan, Grцdig,
Austria) с импульсной ксеноновой лампой. Использованы следующие параметры:
светофильтр для выделения излучения в области 360±35 нм, светофильтр для
выделения эмиссии в области 535±25 нм, задержка по времени 40 мкс, время
интегрирования сигнала 1400 мкс, 10 повторов, температура 25°С.
Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометрах UV-2401 PC (Shimadzu) и
Lаmbda-9 UV/VIS/NIR (Perkin Elmer).
ИК-спектры образцов в виде таблеток с КBr записывали в области
400-4000 см-1 с использованием спектрофотометра FTIR – 8400 S (Shimadzu).
Значения энергии триплетных состояний органических реагентов определяли на
основании анализа спектров фосфоресценции их комплексов с гадолинием при 77єK
[[ccxv]].
Для получения кривых затухания люминесценции изученных комплексов использовали:
возбуждение образца импульсами света длительностью до 6 мс, с временным
разрешением 10 мкс и 30 повторами. Для вычисления значений