Вы здесь

Комплексна діагностика пухлини у хворих з невідомою первинною локалізацією з застосуванням імуногістохімічного методу

Автор: 
Хайдар Нажетт Хайдар
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2007
Артикул:
0407U003676
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

ГЛАВА 2
Материалы и методы исследования
2.1. Материалы исследования
В основу работы положен анализ историй болезни, амбулаторных карточек пациентов, данных комплексного клинического обследования больных, которые находились на стационарном лечении в Харьковском областном клиническом диспансере, Институте медицинской радиологии им. С.П. Григорьева АМН Украины и в Киевской городской онкологической больнице в период с 2004 по 2006 год.
В исследование были включены 181 человек в возрасте от 40 до 70 лет, у которых на основании морфологического исследования гистологических препаратов (гематоксилин-эозин) был верифицирован диагноз "метастаз низкодифференцированной или недифференцированной злокачественной опухоли", и был установлен клинический диагноз: метастазы злокачественной опухоли в лимфатические узлы из первичного невыявленного очага.
Все пациенты были разделены на 2 группы: основную и контрольную. В основную группу были включены 38 человек, из них 13 женщин и 25 мужчин. В контрольную группу вошли 143 пациента, из которых было 56 женщин и 87 мужчин.
В основной группе пациентов в план обследования было включено дополнительно ИГХ исследование парафиновых блоков для установления гистогенеза (фенотипа) и органопринадлежности опухоли. После проведения диагностических мероприятий был установлен окончательный диагноз и назначено соответствующее ему лечение. В контрольной группе пациенты были обследованы согласно стандартному плану без использования ИГХ метода, после чего было назначено лечение по стандартным схемам.
2.2. Методы исследования

У всех 181 больных было проведено морфологическое исследование гистологических препаратов (гематоксилин-эозин) и верифицирован диагноз: метастазы низкодифференцированной и недифференцированной злокачественной опухоли. В основной группе (38 пациентов) было дополнительно проведено ИГХ исследование парафиновых блоков. Для этого готовились парафиновые срезы опухолевой ткани толщиной 4-5 мкм, которые наносились на специальные стекла с Poly-L-Lysin. ИГХ исследование проводилось согласно стандартному протоколу LSAB+ (авидин-биотин-пероксидазный комплекс) метода с использованием kit фирмы "ДАКО" (Дания). Депарафинизированные и дегидратированные срезы инкубировали в цитратном буфере рН 6,0 на водяной бане при 90-96 0С, из воды стекла со срезами помещали на 1 минуту в дистиллированную воду, а затем в Трис-HCl буфер pH 7,4 (ТБС) на 10 мин. Блокировали эндогенную пероксидазу, помещая контейнер со стеклами в 3% водный раствор перекиси на 10 минут, после чего промывали в 2-х сменах дистиллированной воды по 5 минут, а затем - в 2-х сменах ТБС по 5 минут. Инкубация с нормальной неиммунной кролячьей сывороткой проводилась в течение 30 минут при комнатной температуре. Инкубация с первыми (специфичными) антителами проводилась в течение 60 минут в термостате при +37 0С, после чего следовала промывка в 2 сменах ТБС по 5 минут. Инкубация со вторыми биотинилированными антителами проводилась в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего следовала промывка в 2-х сменах ТБС по 5 минут. Затем проводилась инкубация со стрептавидин-биотин-пероксидазным комплексом в течение 30 минут при комнатной температуре, и после этого срезы вновь отмывали в 2 сменах ТБС по 5 минут. На срезы на 10 минут наносили 0,05% раствор ДАБ (3,3-диаминобензидин) в трис-буфере рН 4,1. После этого срезы дважды по 5 минут промывали в дистиллированной воде и докрашивали гематоксилином. Далее срезы обезвоживали в спиртах, осветляли в ксилоле и заключали в бальзам.
Для выявления опухолевых антигенов при помощи антител к цитокератинам демаскировка антигенов проводилась при помощи ферментативной обработки трипсином. Так, после депарафинизации и дегидратации следовала промывка в течение 3 минут в дистиллированной воде, а затем - блокирование эндогенной пероксидазы, как указано выше. После промывки в 2-х сменах дистиллированной воды по 5 минут, срезы прогревали в дистиллированной воде при 37 0С в течение 5 минут. Затем стряхивали со срезов воду, помещали в тёплый раствор трипсина с CaCl2 и инкубировали в термостате при 37 0С в течение 15 минут. Ферментативную обработку останавливали путем опускания стекол со срезами в дистиллированную воду на 2 минуты, затем промывали в ТБС в течение 5 минут и помещали на холод на 20 минут. После этого снова промывали в ТБС в течение 5 минут и наносили на срезы нормальную иммунную сыворотку на 30 минут. Далее следовали этапы, описанные выше.
При использовании таких маркеров как S-100 и HMB-45 демаскировка антигенов не проводилась, в остальном же протокол ИГХ исследования не отличался от указанного выше.
Оценку ИГХ реакции проводили по качественному принципу: отрицательный результат (-), слабоположительный (±) и положительный (+). Для оценки экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона использовали систему подсчета Histo score (H.S.). Показатель H.S. от 0 до 10 обозначает отрицательный результат ИГХ реакции, при H.S. от 10 до 100 результат слабоположительный и при H.S. от 100 до 300 результат является положительным. Подсчет проводился в трех когортах по 100 опухолевых клеток в различных полях зрения (объектив ? 40).
Используемая панель МкАТ и ПкАТ состояла из 25 маркеров (табл. 2.1.1). Выбор антител, которые были использованы в диагностической панели, был обусловлен необходимостью установить гистогенез (фенотип) и органопринадлежность метастаза анонимной опухоли при помощи минимального количества наиболее информативных маркеров.
Таблица 2.1.1
Общая панель используемых в работе антител
Название антитела КлонФирма - производительCD 45PD7/26DakoCКpanAE1 and AE3DakoCK 7OV-TL 12/30DakoCK 20K 20.8DakoCK HMW34bE12DakoCK 835bH11DakoEGFRHER -1DakoProstate Specific Antigen (PSA)ER-PR8DakoProstatic Acid Phosphatase (PSAP)REFDakoChorionic Gonadotropin (HCG)PolyclonalDakoCarcinoembryonic antigen (CEA)REFDakoSynaptophysinSY38DakoHMB-45HMB-45DakoEMAE29DakoTTF-18G7G3/1DakoER1D5DakoPR636