Вы здесь

Властивості і функціональна роль систем Na+-залежного і Na+-незалежного виходу Са2+ з мітохондрій печінки і міокарда

Автор: 
Наливайко Наталія Володимирівна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2007
Артикул:
3407U004083
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1.Умови проведення досліджень
Дослідження кінетичних властивостей систем Na+- і Н+-залежного виходу Ca2+ з
мітохондрій печінки і міокарда і взаємодії їх з катіонами одно- та двовалентних
металів проводили в умовах in vitro. Мітохондрії ізолювали з печінки і міокарда
білих щурів масою 200 – 300 г. Тварин утримували в умовах віварію за
стаціонарного режиму харчування. Дослідження на тваринах проводили з
дотриманням усіх вимог щодо роботи з лабораторними тваринами (міжнародна
конвенція, Страсбург, 1986). У дослідах використовували самців віком два –
чотири місяці. Для дослідження специфічності мітохондріальних
Са2+-транспортувальних систем по відношенню до катіонів металів були підібрані
іони одновалентних (Tl+, Li+, Rb+, K+ і Cs+) та двовалентних (Ba2+, Sr2+, Mg2+
і Mn2+) металів, які характеризуються різними фізико-хімічними властивостями,
зокрема радіусом іона, електронегативністю, спорідненістю до кисневмісних
біолігандів та рядом інших параметрів. У дослідах використовували хлориди
металів, за винятком Tl+, який використовували у формі нітрату.
Експериментальні дослідження включали такі основні етапи:
Дослідження залежності швидкості Na+- і Н+-залежного виходу Са2+ з мітохондрій
печінки і міокарда від вмісту кальцію в цих органелах.
Дослідження залежності швидкості Na+- і Н+-залежного виходу Са2+ з мітохондрій
печінки і міокарда від концентрації Na+ і H+ у позамітохондріальному просторі.
Дослідження температурної залежності швидкості Na+- і Н+-залежного виходу Са2+
з мітохондрій печінки щурів.
Інгібіторний аналіз взаємодії систем Na+- і Н+-залежного виходу Са2+ з
мітохондрій печінки і міокарда щурів з іонами одновалентних металів (Tl+, Li+,
Rb+, K+, Cs+).
Інгібіторний аналіз взаємодії систем Na+- і Н+-залежного виходу Са2+ з
мітохондрій печінки і міокарда щурів з іонами двовалентних металів (Ba2+, Sr2+,
Mg2+, Mn2+).
Мітохондрії печінки та міокарда білих щурів виділяли методом диференціального
центрифугування [33, 284]. Життєздатність отриманих мітохондрій оцінювали за
ефективністю їх дихання у метаболічних станах за Чансом [120]. Дихання
мітохондрій вивчали полярографічним методом з використанням закритого електрода
Кларка. Вихід Са2+ з мітохондрій реєстрували електрометричним методом з
використанням Са2+-селективного електрода фірми Orion (модель 9320).
У дослідах використовували реактиви кваліфікації х.ч. та осч. (Сінбіас), ADP,
EGTA (“Sigma”, США), рутеній червоний (“Serva”, Німеччина). Усього було
поставлено 29 серій дослідів на 354 тваринах.
2.2. Виділення мітохондрій із печінки і міокарда щурів методом диференціального
центрифугування
Мітохондрії печінки виділяли методом диференціального центрифугування [33,
284]. Декапітацію тварин проводили після інгаляційного наркозу їх диетиловим
ефіром. Печінку швидко виділяли і поміщали на 10 хв. у середовище
гомогенізації, охолоджене до появи плаваючих кристалів (-2°С). Охолоджену
тканину подрібнювали, пропускаючи через прес і гомогенізували у гомогенізаторі
Поттера-Ельвенгейма з розрахунку 1 г тканини на 8 мл середовища гомогенізації
із швидкістю обертання 300 обертів за хвилину і трьох вертикальних ходах
поршня. Середовище гомогенізації мітохондрій печінки містило (ммоль/л):
сахароза - 300, триоксиметиламінометан (тріс) - 10,
етиленглікольдиамінотетраацетат (EGTA) – 1 (рН - 7,4). Отриманий 12 % гомогенат
центрифугували у два етапи (рис. 2.1). На першому етапі осаджували
великодисперсні залишки тканини та фракцію ядер шляхом ценирифугування
гомогенату протягом 3 хв. при 150g і 4 хв. при 330g без зупинки ротора.
Мітохондріальну фракцію отримували центрифугуванням супернатанту протягом 10 хв
при 4500g. Отриманий осад мітохондрій ресуспендували у середовищі
гомогенізації, що не містило ЕGТА і повторно центрифугували протягом 10 хв. при
4500 g. Отриманий осад мітохондріальної фракції суспендували у середовищі
гомогенізації без EGTA для отримання суспензії мітохондрій з кінцевою
концентрацією 70 - 80 мг мітохондріального білка в 1 мл.
Рис. 2.1. Основні етапи одержання ізольованих мітохондрій методом
диференціального центрифугування
Виділення мітохондрій з міокарда проводили з окремими модифікаціями. Зокрема,
охолоджену тканину спочатку подрібнювали у гомогенізаторі Polytron, а після
цього гомогенізували у гомогенізаторі Поттера-Ельвенгейма з розрахунку 1 г
тканини на 8 мл середовища гомогенізації із швидкістю обертання 300 обертів за
хвилину і трьох вертикальних ходах поршня. Середовище гомогенізації мітохондрій
міокарда містило (ммоль/л): манітол – 210, сахароза – 70, тріс – 10,
етилендиамінтатраацетат (ЕDТА) – 3, альбумін сироватки бика (БСА) – 0,1% (рН
7,4). Отриманий 12 % гомогенат центрифугували у два етапи, як і під час
виділення мітохондрій з печінки. Мітохондріальну фракцію отримували
центрифугуванням супернатанту протягом 10 хв. при 10000g. Отриманий осад
мітохондрій ресуспендували у середовищі гомогенізації, що не містило ЕDТА і
повторно центрифугували протягом 10 хв. при 10000g. Мітохондріальну фракцію
повторно суспендували у середовищі гомогенізації без ЕDТА для отримання
суспензії мітохондрій з кінцевою концентрацією 70 - 80 мг мітохондріального
білка в 1 мл. Вміст білка у суспензії мітохондрій печінки і міокарда визначали
за методом О. Лоурі [220].
Розчини, посуд і інструменти, які використовували при виділенні мітохондрій
попередньо охолоджували. Всі операції, пов’язані з отриманням мітохондрій
печінки і міокарда, проводили при температурі 0 – +2° С. Отриману суспензію
мітохондрій