Вы здесь

Бактеріальний опік плодових: резервація, прогноз та засоби обмеження захворювання

Автор: 
Барбакар Олександр Володимирович
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2007
Артикул:
0407U004188
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Пошук літературних джерел з проблематики досліджень проводили у бібліотеках
Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного, ЦСГБ УААН, ЦНБ ім.
Вернадського та світовій мережі INTERNET.
Матеріалом для досліджень стали пагони, листки та пелюстки квіток грушевих
дерев, відібрані під час весняних, літніх та осінніх обстежень. Рослинний
матеріал для досліджень відбирали в грушевих та яблуневих садах
Придністровської науково-дослідної станції Буковинського інституту
агропромислового виробництва (Чернівецька область) протягом 2001 – 2003 рр.,
садах Інституту садівництва УААН (с. Новосілки, с. Дмитрівка
Києво-Святошинського району) – протягом 2004 – 2006 років. Відбір зразків
уражених органів дерев проводили в наступні періоди вегетації – навесні (період
цвітіння та інтенсивного росту пагонів), влітку (період плодоношення) та
восени.
Поширення та ступінь ураженості дерев збудником бактеріального опіку плодових
визначали за шкалою Т. Звета та ін. (1970) у відсотках. Оцінку ступеня ураження
крони проводили в три періоди: цвітіння, росту пагонів та плодоношення.
Мікробіологічний аналіз зразків проводили за методиками К.І. Бельтюкової зі
співавт. (1968) [3] та Клемента [95].
Для виділення бактерій з досліджуваного зразка вирізали невеликі шматочки
розміром приблизно 5х5 мм ураженої тканини на межі зі здоровою і промивали під
струменем водогінної води протягом 5 хв., ополіскували стерильною водогінною
водою і гомогенізували в стерильній ступці з 1 – 2 краплинами стерильної води.
Отриману суспензію висівали за допомогою бактеріологічної петлі на пластинки
картопляного агару (КА) з додаванням 0,5% дріжджового автолізату в чашки
Петрі.
В здерев’янілих зразках виявлення бактерій проводили методом тирси. Для цього
зразок ретельно промивали водогінною водою, потім стерильною водогінною водою,
просушували стерильним фільтрувальним папером, обливали (або занурювали) 960
спиртом і обпалювали. За наявності в тканині бактерій вони рясно обростали
кругом тирси. Вирослу бактеріальну масу розсівали на КА для отримання окремих
колоній.
Після посіву чашки витримували в термостаті при температурі 26 – 270С і щоденно
спостерігали за ростом і формою колоній. Колонії відсівали на косий агар в
пробірки для подальшого вивчення їх патогенних, культуральних, морфологічних,
фізіолого-біохімічних та інших властивостей.
Виділення мікроорганізмів епіфітної мікрофлори було проведене за трьома
варіантами наступним чином:
1 – листки або пелюстки поміщали в колбу, додавали 100 мл стерильної водогінної
води, ретельно перемішували чи струшували протягом 5 хв., з вихідної суспензії
піпеткою брали 1 мл рідини, переносили її у пробірку, куди потім додавали 9 мл
стерильної води (розведення 1:10) і виконували п’ятикратне розведення. З
третього та п’ятого розведень піпеткою відбирали 0,1 мл рідини і переносили у
чашки Петрі з агаризованим середовищем, стерильним шпателем злегка розтирали
суцільно по всій площі чашки;
2–злистків або пелюсток робили мазок стерильною петлею і проводили висів на
чашку Петрі на пластинки КА;
3–злисків або пелюсток методом відбитків робили висів на КА.
Мікробіологічний аналіз відібраних зразків проводили на базі Інституту
мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного за методиками, описаними в
роботах К.І. Бельтюкової зі співавторами, М.А. Чумаєвської зі співавторами, 3.
Клемента та інших [3, 95].
З метою вивчення епіфітної мікрофлори грушевих дерев визначали наявність як
сапрофітних, так і фітопатогенних мікроорганізмів на поверхні листків протягом
всього вегетаційного періоду. Відбирали середню пробу вагою 10 г, частину якої
переносили в колби із стерильною водогінною водою (100 мл) та збовтували на
качалці 30 с., після чого 0,1 мл рідини розтирали шпателем по поверхні
пластинок з КА, середовищем Кінга В та Д3. Решту листків поміщали в стерильні
поліетиленові пакети і згодом використовували для лабораторних досліджень з
метою вивчення епіфітної мікрофлори методом відбитків.
Патогенні властивості виділених ізолятів вивчали в лабораторних умовах. Для
цього проводили штучне зараження пагонів груші, зрізаних в лютому-березні, і
поміщали їх в посуд з водою. Заражали бруньки і кору. Інокуляцію здійснювали
методом уколів через краплину суспензії клітин патогену та ін’єкцій
бактеріальною суспензією в концентрації 108 клітин в 1 мл стерильної водогінної
води [3]. У всіх випадках для зараження використовували бактеріальну масу, яка
виросла на КА протягом 1 – 2 діб при температурі 280С.
Результат враховували за 5-ти бальною шкалою на 3, 5, 7, 14, 21 добу:
0 – ознаки ураження відсутні;
1 – некроз 5 – 10 мм;
2 – некротична пляма 10 – 25 мм, оточуючі листки і бруньки мертві;
3 – Ѕ пагона і більше почорніли;
4 – пагін мертвий.
З цією ж метою проводили штучне зараження недозрілих плодів груші за методом
Уайта [94]. При зараженні за цим методом патологічний процес проходить із
виділенням сіро-білого ексудату, що є характерним тільки для E. amylovora.
Плоди інокулювали методом уколів через краплю суспензії клітин патогену титром
108 в 1 мл води. Результат враховували на 4-ту добу за 5-ти бальною шкалою:
0 – ознаки ураження відсутні;
1 – некроз від злиття трьох уколів;
2 – пляма величиною в 1/3 плоду;
3 – некротична пляма Ѕ поверхні плоду;
4 – загибель плоду.
Здатність ізолятів викликати реакцію надчутливості (РНЧ) листків тютюну
вивчалась за методом З. Клемента [95]. Для інокуляції використовували водну
суспензію однодобової культури з концентрацією бактеріальних клітин 108 в 1 мл
води. Суспензію вводили в листки тютюну під епідерміс біля бокових жилок.
Розвиток нек