Вы здесь

Вікові особливості мітохондріального дихання та перекисного окиснення ліпідів у тварин при активації системи оксиду азоту.

Автор: 
Муращук Катерина Михайлівна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2008
Артикул:
3408U000602
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

Розділ 2
Матеріали і методи досліджень
2.1. Об’єкт досліджень. Досліди виконували на 243 білих лабораторних
безпородних щурах-самцях. Кожен період індивідуального розвитку
характеризується специфічними анатомічними та функціональними особливостями. На
сьогодні загальноприйнятої класифікації вікових періодів життя щурів немає,
проте є кілька критеріїв, за якими стає можливо виділити основні етапи їх
онтогенезу. Основним критерієм для періодизації у даній роботі було статеве
дозрівання. Згідно цього нами було виділено такі вікові групи:
Статево незрілі щурі – віком до 6 тижнів, масою тіла 50-60 г.
Молоді щурі – віком 5-6 місяців, масою тіла 180-210 г.
Старі щурі – віком 18-24 місяці, масою тіла 450-500 г.
Окрім точних відомостей про вік тварин при поділі на групи, ми враховували і
інші ознаки того чи іншого вікового періоду, такі як: маса тіла та зовнішній
вигляд (пожовтіння шерстяного покриву та огрубіння епідермального шару шкіри –
для старих щурів). Особливу увагу звертали на збалансованість раціону, оскільки
зміна калорійності у харчуванні може слугувати фактором пролонгації або
сповільнення процесів старіння. Усіх тварин утримували в стаціонарних умовах
віварію при постійній температурі.
Враховуючи досить високу чутливість енергопродукуючих процесів у МХ, в роботі
звертали особливу увагу на забезпечення спокійного стану тварин при роботі із
ними, оскільки впливати на досліджувані функціональні показники можуть навіть
звичайні маніпуляції із тваринами (відкривання клітки, перенесення з віварію і
т.д.).
При дослідженні впливу активації NO-ергічної ланки на процеси енергетичного
забезпечення, ПОЛ та активність системи АОЗ тваринам різного віку одноразово
внутрішньоочеревно вводили: L-аргінін фірми “Sigma”, США, дозою 600 мг/кг або
L-NNА, фірми “Sigma”, США, дозою 35 мг/кг маси тварин [26]. Час дії кожного
препарату складав 30 хв., після чого проводили швидке декапітування. Контролем
слугувала група тварин, яким вводили 1 мл фізіологічного розчину.
2.2. Метод виділення мітохондрій з печінки щурів. Ізольовані МХ печінки
виділяли за методом, що дає змогу зберегти їх нативність [33]. Відпрепарований
з декапітованих тварин орган зберігали протягом 10 хв в крижаному середовищі
виділення (-20С), яке містило (мМ): KCl – 120, HEPES – 10, EГTA – 1, К2СО3 – 2,
pH 7,2 [33]. Охолоджену тканину перфузували та подрібнювали, пропускаючи через
прес, і гомогенізували в гомогенізаторі Поттера-Евельгейма при швидкості
обертів 300/хв і 3 вертикальних ходах товкачика. З 8%-го гомогенату
центрифугуванням поетапно осаджували фракцію ядер: 3 хв при 150 g і 4 хв при
300 g без зупинки центрифуги. Мітохондріальну фракцію отримували
центрифугуванням супернатанту протягом 10 хв при 4500 g. Отриманий непромитий
осад регомогенізували вручну (один вертикальний хід товкачика) з середовищем
виділення. Отримані нативні мітохондрії впродовж досліджень утримували на
льодяній бані.
2.3. Метод виділення мітохондрій з серця щурів. Виділений з організму щура
міокард поміщали у охолоджене середовище виділення (-20С), згідно
загальноприйнятої методики, яке містило (мМ): KCl – 180, HEPES – 10, EGTA – 10
(рН 7,2) та 0,5% бичачого сироваткового альбуміну. Після відпрепарування аорти
міокард механічно подрібнювали та гомогенізували при швидкості обертів 300/хв.
Отримували фракцію мітохондрій методом диференційного центрифугування за
аналогічною як для печінки схемою.
2.4. Полярографічне вимірювання швидкості дихання біологічних суспензій.
Полярографія – це електрохімічний метод, в основі якого лежить автоматична
реєстрація сили струму при поступовому збільшенні напруги на електродах,
занурених в розчин, що досліджується. В полярографічному методі використовують
явище концентраційної поляризації, яке виникає на електроді з малою поверхнею
при пропусканні електричного струму крізь розчин електролітів. Цей метод
дозволяє досліджувати як неорганічні, так і органічні речовини, які здатні
окислюватись або відновлюватись на поверхні електродів при проходженні
постійного електричного струму. За допомогою полярографії можна виявляти
наявність і концентрацію багатьох біомолекул (амінокислот, гормонів, вітамінів)
та їхні компоненти, а також, при дослідженні біологічних об’єктів, застосовуючи
цей метод для вивчення ферментативної активності білків, та взаємозв’язків між
коферментами і апоферментами. Значущість полярографічного методу полягає також
в тому, що його застосовують для вимірювання концентрації кисню в розчині. Це
дозволяє використовувати метод для автоматичної реєстрації метаболічних
процесів, які змінюються в короткі проміжки часу; з високою чутливістю
проводити дослідження насамперед процесів дихання в мітохондріях.
Отже, сам метод базується на реєстрації електрохімічного відновлення фізично
розчиненого кисню на катоді при накладанні потенціалу 0,6 – 0,7 В, яке
відбувається за реакціями:
О2 + 2Н+ + 2е = Н2О2
Н2О2 + 2Н+ + 2е = Н2О
Струм, який виникає при цьому, є пропорційним кількості молекул кисню, що
дифундують до вимірювального електроду. Якщо в замкненому об’ємі знаходиться
споживач кисню (мітохондрії), то за зменшенням його концентрації можна судити
про швидкість дихання.
Величину дифузного струму реєстрували за допомогою полярографічної установки
YSI 5300, самописця КСП-4. Суспензію утримували у скляній термостатованій
закритій комірці об’ємом 1,5 мл, приєднану до магнітної мішалки, для
перемішування суспензії. Детальний опис методу наведений у роботі [67]. Типова
полярограма представлена на рис. 2.1. Середовище інкубації мітохондрій печінки
містило (мМ): KCl – 120, KH2PO4 – 2, HEPES – 10,