Вы здесь

Дослідження антивірусної активності 6-азацитидину та амізону у модельній системі: цитомегаловірус - культура клітин фібробластів легень ембріона людини.

Автор: 
Абдуллаєва Майя Володимирівна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2008
Артикул:
0408U000923
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріали дослідження
Вірус
Цитомегаловірус людини (референс-штам ЦМВ AD 169), у вигляді продукуючої
культури ФЛЕЛ, люб'язно наданий доктором L. Pereira (Медичний Центр,
Університет Сан-Франциско, США). Вірус зберігався при температурі –700С.
Культура клітин
У дослідах використовували первинну культуру клітин ФЛЕЛ (фібробластів легень
ембріона людини), яка входить до Каталогу Європейської колекції культур клітин
[107]. Лінія клітин ФЛЕЛ була отримана з банку клітинних культур Інституту
вірусології ім. Д.І. Івановського РАМН.

Поживні середовища
Для культивування культури клітин ФЛЕЛ використовували такі поживні середовища,
як Ігла ДМЕМ, Ігла МЕМ, з використанням розчину Версену та Хенксу виробництва
фірми “Панеко” Росія та Хімопсину фірми “Самсон-Мед” Росія. Як стимулятор росту
використовували ембріональної телячу сироватка виробництва фірми “Hy Clone” США
чи “Biowest” Франція та пуповинну сироватку людини виробництва фірми “Панеко”
Росія.
Лейкоцити та сироватки периферичної крові хворих
Досліджували лейкоцити та сироватку периферичної крові від 50 дітей віком від
1-го дня до 1-го року життя та 17 пацієнтів після трансплантації нирки.
Буферні розчини
При дослідженнях використовували буферні розчини: 0.01 М фосфатно-сольовий
буфер рН 7.5, який містить 0.1 М NaCl, 0.025M KCl, 0,025M KH2PO4, 0.036M
Na2HPO4x12H2O; 0.005 М розчин Трис- HCl рН 7.4, який містить 0.1 М Na Cl.

Моноклональні антитіла, кон'югати та субстрат
У роботі використовували оригінальні очищені МКА до білків р72, рр65, gВ ЦМВ,
що були отримані в НДІ вірусології ім. Д.І. Івановського АМН Росії [31], у
робочих розведеннях:
р72 – 1: 100;
рр65 – 1: 100;
gB - 1: 100.
Як кон'югат використовували поліклональні кролячі анти-мишачі імуноглобуліни,
мічені пероксидазою хрону “DakoCytomation” Данія у робочому розведенні 1: 100.
Як субстрат використовували диамінобензидин (DAВ) “Bioscinces” США у
концентрації 10 млг DAВ розведеного в 20 мл 0,005 М розчині буферу ТРИС рН 7.4
з додаванням 20 мкл 30% перекису водню (розрахунок на один планшет).
Стандартні тест-системи
При проведенні досліджень використовували комерційні тест-системи “Enzygnost
Anti-CMV/Ig” фірми Behring та ELISa фірми “HUMAN” Німеччина, для визначення
специфічних антитіл класів М і G у сироватках крові до ЦМВ методом ІФА.
ДНК ЦМВ в зразках сироваток крові реципієнтів нирки виявляли за допомогою
реактивів набору ЦИТОПОЛ (ТУ-9398-428-17253567-01) виробництва ТОВ НПФ "Літех"
(Москва) и ТОВ НПФ "ГЕНтех" (Москва).
ІФА та ПЛР у цих випадках та облік результатів здійснювали відповідно до
інструкцій фірм-виробників.
Антивірусні сполуки та препарати
- 6-АЗЦ (2-Я-Д-рибофуранозил-5-аміно-1,2,4-триазин-3(2Н)-ВІН), синте-
зований в Інститут молекулярної біології і генетики НАН України;
- Амізон 4-(N-бензил)амінокарбоніл-1-метилпіридиній йодид, синтезований в
Інституті фармакології і токсикології АМН України;
Ганцикловір, вироблений фірмою “Hoffmann-La Roche Ltd”, Швейцарія.
Антивірусні сполуки та препарат розчиняли у поживному середовищі Ігла ДМЕМ,
фільтрували через стерилізуючі фільтри фірми “Millipore” з розміром пор 0,22
мкм. Робочі розведення готували на середовищі росту (90% середовища Ігла ДМЕМ,
5% сироватки ембріона теляти та 5% пуповинної сироватки людини).
2.2. Методи дослідження
При виконанні даної роботи були використані такі методи:
швидкий культуральний, що включав вірусологічний – культивування пермісивної до
ЦМВ культури клітин, накопичення ЦМВ в клітинах та імуноцитохімічний -
виявлення вірусоспецифічних білків ЦМВ у інфікованих клітинах ФЛЕЛ із
застосуванням поліклональних кролячих анти-мишачих імуноглобулінів,
коньюгованих з пероксидазою хрону;
тест на виявлення антигенемії – виявлення вірусоспецифічного білку ЦМВ рр 65;
цитологічні – досліджували життєздатність клітини під впливом різних
концентрацій сполук; підраховували число живих та не живих клітин, а також
кількість клітин з міченим та не міченим [метил-Н3] тимідином ДНК.
імунологічні – визначення антигену до ЦМВ, проведення імуноферментного
аналізу;
статистичні методи.
2.2.1. Культивування культури клітин ФЛЕЛ
Культуру клітин пересівали з використанням розчину Версену “Панеко” Росія та
Хімопсину “Самсон-Мед” Росія через 3 доби. Середовище росту для клітин ФЛЕЛ
містило 90% середовища Ігла ДМЕМ “Панеко” Росія, 5% ембріональної телячої
сироватка “Hy Clone” США чи “Biowest” Франція, 5% пуповинної сироватка людини
“Панеко” Росія, 146 мг 2 мМ L-глютаміну “Панеко” Росія, і 50 мкг/мл гентаміцину
“Львівдіалект” Україна. Клітини ФЛЕЛ вирощували у пластикових культуральних
флаконах (105 – 106 кл/мл) при +370С у термостаті в атмосфері 5% СО2.
2.2.2. Культивування вірусу
ЦМВ підтримували шляхом пасування на культурі клітин ФЛЕЛ. Інфекційна
множинність інокуляту становила 0,1-1,0 БУО/кл. Адсорбцію вірусу проводили
протягом 1 год. при +370С. Потім вносили середовище підтримки, що складалось із
середовища Ігла МЕМ “Панеко” Росія із 2% ембріональної телячої сироватка “Hy
Clone” США чи “Biowest” Франція. Інфіковані клітини інкубували при температурі
+ 370С до виявлення ознак ЦПД. Збір вірусовмісної рідини робили при виявленні
90% ЦПД у моношарі (через 2-3 тижні).
Для звільнення від фрагментів клітинного детриту, вірусовмісну рідину
центрифугували при 2000 об./хв. протягом 10-15 хв. на центрифузі JA-14
“Beckman” Німеччина.
2.2.3. Методика визначення інфекційного титру вірусу
Інфекційний титр вірусу визначали в культурі ФЛЕЛ методом бляшок