Вы здесь

Біотехнологія Т-2 токсину та обгрунтування максимально допустимого рівня його в кормах для молодняку великої рогатої худоби на відгодівлі

Автор: 
Васянович Ольга Миколаївна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2008
Артикул:
0408U001208
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Робота виконувалася в лабораторії мікотоксикології Інституту ветеринарної медицини протягом 1987-2004 рр. У дослідах щодо вивчення дії Т-2 токсину на тварин було використано 51 голову молодняку великої рогатої худоби чорно-рябої породи. Дослід проводили згідно з наведеною схемою (рис.2.1).

Рис. 2.1. Загальна схема проведення досліджень

Матеріалом мікологічних досліджень були 485 проб кормів, що надходили з різних типів сільгосппідприємств і різних областей України: Дніпропетровської, Донецької, Житомирської, Київської, Сумської, Черкаської та Чернігівської в період збирання й зберігання. Зразки середніх проб відбирали відповідно до діючих державних стандартів (ГОСТ 13586, 3-83).
У роботі ми використали мікологічні, мікотоксикологічні, клінічні та інші методи досліджень.
2.1. Мікологічні методи досліджень
Гриби з відібраних зразків виділяли методом серійних розведень суспензій подрібнених на млинку кормів. Наважку змеленого корму масою 10 г поміщали в колбу з 90 см3 стерильної води, струшували протягом 20-30 хв, готували розведення 1:1000 та 1:10 000 і висівали на агаризовані середовища Чапека та Сабуро по 0,1 см3 суспензії. Крім того, гриби виділяли методом розкладання зерен і шматочків корму на агаризоване середовище Чапека в чашках Петрі. Посіви інкубували за температури 24 і 30 ?С упродовж 5-8 діб, після чого підраховували кількість діаспор в 1 г корму.
Мікроміцети ідентифікували за визначниками Д.К. Зерова (1971) [223], М.М.Підоплічка (1977) [224], М.С. Даньшина (1985) [225] і Д.Саттона зі співавторами (2001) [226].
Токсичні властивості ізольованих грибів вивчали шляхом дії їхніх культуральних рідин на тест-мікроорганізм Тетрахімена піріформіс під час змішування в об'ємному співвідношенні 1:1 [227]. Визначали й оцінювали результати через 30 і 60 хв, враховуючи ефект біопроби в краплі. Токсичні штами спричиняли загибель Тетрахімени піріформіс протягом 30 хв, слаботоксичні - 1 год, нетоксичні - загибелі та будь-яких морфологічних змін в інфузорій не викликали.
2.2. Мікотоксикологічні методи досліджень
Токсичні й слаботоксичні види грибів відносно тест-мікроорганізму Тетрахімена піріформіс досліджували на здатність утворювати Т-2 токсин за експрес-методом, розробленим нами в лабораторії мікотоксикології. Для цього штами грибів, вирощені на твердому поживному середовищі Чапека, екстрагували 10 см3 етилацетату впродовж 8 год. Одержані екстракти фільтрували через паперовий фільтр і випарювали у вакуумі за температури 50 ?С до сухого залишку. Потім останній перерозчиняли в 1см3 етилацетату і наносили на хроматографічні пластини в кількості 10-20 мкл. Пластини хроматографували в системі розчинників толуол-етилацетат-мурашина кислота в об?ємному співвідношенні 5:4:1. Для виявлення Т-2 токсину пластини обробляли 20% спиртовим розчином Н2SO4 із послідовним нагріванням за температури 130 ?С протягом 3 хв та продивлялися в УФ-променях із довжиною хвилі 254 і 365 нм.
Штами, які продукували Т-2 токсин, висівали на різні поживні субстрати й культивували за різних температурних режимів з метою вивчення їхнього оптимального токсиноутворення.
У дослідах використовували Т-2 токсин, який був одержаний нами в лабораторії мікотоксикології й відповідав вимогам ТУ 10-07-77-91, затверджених Головним управлінням ветеринарної медицини з Держветінспекцією у 1991 р., а також культуру гриба-продуцента Fusarium sporotrichiella var.poae Bilai штам 407/4, одержаний лабораторією з відділу незаразних хвороб Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини від доктора ветеринарних наук В.В. Рухляди (м.Кіровоград).
Т-2 токсин одержували згідно з методом, описаним в Інструкції по виготовлення та контролю Т-2 токсину для мікологічних досліджень, затвердженої в Інституті ветеринарної медицини УААН.
Щоб отримати необхідну кількість Т-2 токсину, постійно модифікували метод одержання токсину з культури гриба. Спочатку гриб-продуцент культивували на зволоженому просі за температури 4 ?С протягом 90 діб, а в подальшій роботі - на зволоженому житі сім діб за температури 24 ?С, потім один місяць витримували за температури 4 ?С.
Для екстракції Т-2 токсину з культури гриба-продуцента використовували ацетон та етилацетат, а для наповнення хроматографічних колонок з метою порівняння - окис алюмінію нейтральний 40/400 мкм, окис алюмінію лужний 40/250 мкм, силікагель 100/400 мкм чеського виробництва й окис алюмінію для хроматографії ТУ-6-09-3916-75 вітчизняного виробництва.
Т-2 токсин із колонки елюювали сумішшю семи фракцій розчинників: гексан, 2-гексан-бензол (в об?ємному співвідношенні 1:9), 3-гексан-бензол (у співвідношенні 1:7), 4-гексан-бензол (1:5), 5-гексан-бензол (1:3), 6-гексан-бензол (1:2), 7-гексан-бензол (1:1). У подальшій роботі ця схема елюювання токсину з хроматографічної колонки була спрощена. Замість зазначених вище семи фракцій елюювання проводили трьома: гексаном, гексан-бензолом та бензолом.
Т-2 токсин після ряду експериментів одержували таким способом: гриб-продуцент культивували на зволоженому житі за температури 24 ?С протягом семи діб, а потім витримували 30 діб за температури 4 ?С. Вирощену на житі культуру гриба-продуцента три рази екстрагували етилацетатом. Одержані екстракти фільтрували і випарювали у вакуумі до маслянистого залишку, в який додавали невелику кількість окису алюмінію, й досуха випарювали у вакуумі. Сухий залишок окису алюмінію з екстрактом вносили в хроматографічну колонку, заповнену окисом алюмінію. Елюювали токсин із хроматографічної колонки спочатку гексаном, після цього сумішшю гексан-бензолу. Фракції, які одержували під час елюювання токсину із хроматографічної колонки, весь час контролювали на наявність у них Т-2 токсину відповідно до "Методических указаний по обнаружению, идент