Вы здесь

Зміни протеїназно-інгібіторного балансу при рості злоякісних пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину.

Автор: 
Ковтонюк Оксана Володимирівна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2008
Артикул:
0408U001457
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

2.1. Характеристика експериментальних тварин

Експериментальні дослідження проведені на 618 статевозрілих лабораторних тваринах, в тому числі, на 478 мишах лінії С57В1/6 (Black) з початковою масою тіла 18 - 22 г та 140 щурах лінії Wistar з початковою масою тіла 180 - 200 г. З метою уникнення можливого впливу статевих розбіжностей на показники, що вивчались, дослідження проводили виключно на самцях мишей та щурів.
Всі тварини були одержані з розплідника експериментальної бази ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Тварин утримували в стандартних умовах типового віварію на звичайному раціоні харчування (гранульований корм ПК 120-3).
Утримання тварин та робота з ними виконувалися в відповідності до міжнародних правил проведення робіт із лабораторними тваринами.

2.2. Характеристика експериментальних моделей пухлинного росту

У роботі було використано наступні перещеплювані штами: карцинома Герена та карцинома легені Льюїс, які були отримані з Банку клітинних культур ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Карцинома Герена (Guerin carcinoma)
Штам пухлини отриманий від спонтанної аденокарциноми матки щурів лінії Wistar [182]. Для експериментів суспензію клітин карциноми Герена у кількості 2?106 на тварину вводили в 0,5 мл 0,9% стерильного розчину NaCl щурам лінії Вістар підшкірно з правого боку.

Карцинома легені Льюїс (LLС)
Пухлина виникла спонтанно як карцинома легені мишей лінії С57В1/6. Характеризується практично 100% метастазуванням у легені. Вважається, що даний штам пухлини за чутливістю до ПП аналогічний солідним пухлинам людини: адекватний експериментальний пошук антиметастатичних засобів став можливим лише після введення в практику метастазуючої карциноми легені Льюїс [182, 183]. Для експериментів суспензію клітин карциноми легені Льюїс у кількості 2,5?106 на тварину вводили в 0,1 мл середовища 199 мишам лінії С57В1/6 внутрішном'язово в праве стегно.

2.3. Схема вироблення резистентності до цисплатину

Вироблення резистентності пухлин до цисплатину проводили шляхом послідовних перещеплень клітин пухлини, які одержували від тварин, котрим було проведено курс послідовних ін'єкцій цисплатину (рис. 1.2).
У першій серії експерименту 20 щурам перещеплювали клітини карциноми Герена. Після чого тварини були поділені на дві групи: контрольну і дослідну. Щурам дослідної групи на 7 добу після перещеплення пухлини починали вводити цисплатин ("Ebewe", Австрія) в дозі 1,2 мг/кг внутрішньочеревинно через день - всього п'ять ін'єкцій. Щурам контрольної групи за аналогічною схемою вводили стерильний фізіологічний розчин. Тварин із пухлинами, які рецидивували після закінчення курсу хіміотерапії (23 - 25 доба після перещеплення), забивали шляхом декапітації під легким ефірним наркозом. Пухлини тварин дослідної групи використовували для приготування суспензії клітин, які перещеплювали під шкіру щурам другого пасажу.

Рис. 1.2. Схема in vivo вироблення резистентності пухлин до цисплатину

На другому етапі (другий курс введення препарату) тварин знову ділили на контрольну і дослідну групи. Введення ПП тваринам дослідної групи проводили за описаною вище схемою. В експериментах із карциномою Герена було проведено 12 послідовних курсів введення цисплатину.
Аналогічним способом проводили вироблення резистентності карциноми легені Льюїс. В експериментах із даною пухлиною було проведено 27 послідовних курсів введення цисплатину.
У тварин контрольних груп (у щурів - після 12 курсів введення цисплатину, а у мишей - після 9, 19 і 27 курсів введення препарату) вивчали кінетику росту пухлин з паралельним визначенням показників системи протеолізу в плазмі крові та пухлинній тканині.
2.4. Показники дії цисплатину на розвиток трансплантованих пухлин

У якості показника дії цисплатину на ріст пухлин використовували обчислення коефіцієнту гальмування росту пухлин (ГРП) (1) [182]:

ГРП=(Vк-Vд/Vк)?100%, (1)

Vк - об'єм пухлин у контрольній групі (тварини, яким вводили фізрозчин);
Vд - об'єм пухлин у дослідній групі (тварини, яким вводили цисплатин).
Об'єм пухлини у випадку карциноми Герена визначали за формулою Шрека (2):

V= ?/6 ? I1 ? I2? I3, (2)

V, см3 - об'єм пухлини;
I1, I2, I3, см - взаємоперпендикулярні розміри пухлини.

Для карциноми легені Льюїс об'єм пухлини розраховували за формулою (3), що включає розміри кінцівки з пухлиною та інтактної кінцівки [184]:
V= 52 ? (е0,3D2- е0,3D1), (3)
V, мм? - об'єм пухлини;
D2, мм - розмір кінцівки з пухлиною;
D1, мм - розмір інтактної кінцівки.
У випадку з метастазуючою карциномою легені Льюїс визначали також відсоток зменшення середньої кількості легеневих метастазів за формулою (4)
ЗКМ=(Мк-Мд/Мк)?100%, (4)

Мк - кількість метастазів у контрольній групі (тварини, яким вводили фізрозчин);
Мд - кількість метастазів у дослідній групі (тварини, яким вводили цисплатин).
2.5. Кінетичні параметри росту пухлин

Аналіз кінетики пухлинного росту на всіх етапах дослідження проводили для кожної тварини контрольної групи за допомогою математичної моделі Вейбула росту гетерогенних пухлин за формулою (5) [185]:

V=V0 ? exp ((а(t - tlag))?), (5)

V0 - початковий об'єм пухлини, що прищеплюється.
Кінетичні параметри росту пухлини а, ?, tlag визначали для кожної тварини контрольної групи по кінетичних кривих росту, які розраховували методом нелінійної регресії з використанням програми "Microcal Origin 7.0".
Параметр а відображає швидкість росту цілісної пухлини в експоненційній фазі росту і значною мірою залежить від тривалості мітотичного циклу окремих пухлинних клітин.
Параметр ? являється просторовим чинником, який характеризує в обернено-пропорційній залеж