Вы здесь

Вплив збудників захворювань вірусної етіології на реплікативну активність ВІЛ у хворих на ВІЛ-інфекцію

Автор: 
Бабій Наталія Олександрівна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2008
Артикул:
0408U002047
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

2.1.Матеріали

Зразки сироватки крові. Зразки периферичної крові ВІЛ-інфікованих осіб отримували з клініки Державної установи "Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського АМН України" (далі ІЕІХ). З метою одержання сироватки венозну кров збирали в стерильні пробірки типу "VacutainerTM", що не містили антикоагулянтів. З кожної пробірки відбирали сироватку окремими наконечниками з аерозольним бар'єром в одноразові стерильні пластикові пробірки типу "Еppendorf" об'ємом 1,5 - 2 мл. Зразки сироватки крові зберігали при температурі - 70єС. Перед проведенням досліджень зразки сироватки розморожували і зберігали при температурі 2 - 8єС не довше 6 годин. Допускалося тільки однократне заморожування - відтаювання отриманих зразків.
В зразках сироватки крові методом імуноферментного аналізу (ІФА) визначали серологічні маркери інфекцій вірусної етіології.
Було протестовано 425 зразків сироватки крові, отриманих від ВІЛ-інфікованих осіб в різних стадіях ВІЛ-інфекції, 300 з яких отримували ВААРТ.
Зразки плазми крові. Для одержання зразків плазми забір крові проводився в пробірки типу "Vacuette(r)" з 6% розчином ЕДТА із розрахунку 50 мкл ЕДТА на 1 мл крові. Закриті пробірки декілька разів перевертали для перемішування з антикоагулянтом. Пробірку центрифугували 20 хвилин при швидкості ротора 1600 об./хв, після чого відбирали плазму у кількості не менше 1 мл окремими наконечниками з аерозольним бар'єром і переносили в одноразові стерильні пластикові пробірки типу "Еppendorf", об'ємом 1,5мл.
Зразки плазми крові зберігали при температурі - 70єС. Перед проведенням досліджень зразки розморожували і зберігали при температурі 2 - 8єС не довше 6 годин. Допускалося тільки однократне заморожування - відтаювання зразків плазми.
В зразках плазми крові ВІЛ-інфікованих осіб за допомогою методу ПЛР визначали рівень вірусного навантаження ВІЛ-1, а також наявність РНК ВГС та ДНК ВГВ. Зразки плазми крові, що виявилися позитивними на вміст РНК ВГС, використовували для визначення генотипу ВГС та встановлення рівня вірусного навантаження ВГС методом ПЛР.
Кількість вмісту РНК-копій ВІЛ-1 була проаналізована в 125 зразках плазми, отриманих від ВІЛ-інфікованих осіб. На наявність РНК ВГС було протестовано 130 зразків плазми, на наявність ДНК ВГВ - 125 зразків плазми. Рівень вірусного навантаження ВГС встановлено в 34 зразках плазми крові, 16 з яких були отримані від осіб, що приймають високоактивну антиретровірусну терапію (ВААРТ), 18 - від осіб, які не приймають антиретровірусні (АРВ) препарати.
Групи дослідження. З історій хвороб ВІЛ-інфікованих осіб, які перебували на диспансерному обліку у відділенні СНІДу клініки ІЕІХ, були отримані дані щодо віку ВІЛ-інфікованих осіб, шляху інфікування ВІЛ-1, рівня CD4 лімфоцитів, дати початку та схеми ВААРТ.
В дослідження було включено 425 ВІЛ-інфікованих осіб, яких розподілили на три групи: І група - пацієнти, які за класифікацією ВООЗ знаходились в І клінічній стадії ВІЛ-інфекції (стадія безсимптомного вірусоносійства) (75 осіб), ІІ група - пацієнти в ІІІ клінічній стадії ВІЛ-інфекції, які мали клінічні ознаки ВІЛ-інфекції, але поки що не отримували ВААРТ (50 осіб), ІІІ група - ВІЛ-інфіковані пацієнти в ІІІ або ІV клінічній стадії ВІЛ-інфекції, які отримували ВААРТ протягом не менше 6 місяців (300 осіб). Серед ВІЛ-інфікованих пацієнтів, включених у дослідження, було 241 осіб чоловічої статі та 184 - жіночої. Вік пацієнтів коливався від 17 до 47 років.

2.2. Методи

2.2.1. Імуноферментний аналіз. Імуноферментний аналіз застосовували для визначення в зразках сироватки крові серологічних маркерів інфікування ВГВ, ВГС, ВПГ1/2, ЦМВ, ВЕБ, а саме: антитіл класів IgМ та IgG до ВПГ1/2, ЦМВ та капсидного антигену ВЕБ; антитіл класу IgG до ВГС та спектру антитіл (IgG) до окремих антигенів ВГС (core, NS3, NS4, NS5); IgМ+ IgG до НВс-антигену ВГВ та HBsAg.
Специфічні антитіла до антигенів збудників вірусних коінфекцій в зразках сироватки крові ВІЛ-інфікованих осіб виявляли за допомогою тест-систем, призначених для проведення ІФА на твердофазному носії - лунках полістиролових планшетів, сенсибілізованих рекомбінантними антигенами вірусів. Для встановлення наявності поверхневого антигену вірусу гепатиту В (HBsAg), антитіл (IgG та IgM) до корового антигену вірусу гепатиту В (HBcAg), антитіл класу IgG до білків вірусу гепатиту С (core, NS3, NS4, NS5) в сироватці ВІЛ-інфікованих пацієнтів використовували тест-системи виробництва НВО "Діагностичні системи" (Росія) та АТЗТ НВК "Діапроф-мед" (Україна). Для якісного аналізу сироватки крові на наявність антитіл класів IgM та IgG до вірусу простого герпесу 1 і 2 типів та до цитомегаловірусу використовували тест-системи виробництва "Діапроф-мед" (Україна). Для кількісного/якісного виявлення антитіл класів IgM та IgG до капсидного антигену вірусу Епштейна-Барр в зразках сироватки, отриманих від ВІЛ-інфікованих осіб, використовували тест-системи фірми "DiaSorin" (Італія).
Тест-процедура проводилася згідно інструкцій виробника. Для підтвердження позитивних результатів ІФА, процедуру дослідження для відповідного зразка повторювали двічі.
Для проведення ІФА використовували наступне обладнання: термостат для планшетів, автоматичний промивач планшетів, спектрофотометр "Sunrise" ("TECAN", Австрія).
2.2.2. Молекулярно-біологічні методи
2.2.2.1 Полімеразна ланцюгова реакція (якісний аналіз). Методика проведення якісного аналізу з використанням полімеразної ланцюгової реакції включала три етапи:
1. Виділення ДНК(РНК) із клінічного зразка. На цьому етапі клінічні зразки проходили спеціальну обробку, в результаті якої відбувається лізис клітин та видалення білків і полісахаридів для отримання вільного від інгібіторів розчину нуклеїнової кислоти.
2. Ампліфікація специфічних фрагментів ДНК.
3. Детекція продуктів ампліфікації методом горизонтального електрофорезу в агарозному ге