Вы здесь

Розробка імунних біосенсорів для визначення нонілфенолу.

Автор: 
Гордієнко Анна Валеріївна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2008
Артикул:
0408U002236
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Використані реактиви
В ході виконання дисертаційної роботи використано такі реактиви:
- Антитіла кози, отримані на Ig G кроля, мічені пероксидазою хрону (ПХ);
твін-20, тріс, ортофенілендіамін, НФ, білок А від Staphylococcus aureus,
поліаліламін гідрохлорид (ПАА), полістірен сульфонат (ПСС), додекантіол,
глутаровий альдегід, сульфат декстрану – „Sigma-Aldrich”;
- полістіролові плашки - “Dynatech”;
- кон’югати НФ з білками було отримано нижчеописаним способом в Інституті
біохімії ім. А.Н. Баха РАН, м. Москва
- антисироватки, специфічні до НФ отримано шляхом імунізації кролів як описано
нижче в Інституті біоорганічної хіміі НАН республіки Білорусь, м. Мінськ.
Інші реактиви (сульфат амонію, Н2О2, Н2SO4, желатин, етиловий спирт) були
вітчизняного та імпортного виробництва і мали кваліфікацію „ос.ч. ” чи „х.ч.”.
2.2. Підготовка імунних компонентів, необхідних для розробки методів визначення
нонілфенолу
Синтез імуногенних кон'югатів НФ з білками-носіями.
НФ є низькомолекулярною сполукою і не володіє імуногенними властивостями, тому
для проведення імунізації здійснювали кон’югування НФ з білковими носіями, що
досягалось двома шляхами. У першому випадку НФ зв'язували з білком в реакції
Маніха за допомогою формальдегіду [206], яку в загальному вигляді можна
зобразити наступним чином:
В другому випадку структурний аналог НФ, що містить карбоксильну групу, -
7-(р-гідроксифеніл)-гептанову кислоту (ГГК) кон'югували
карбодиімідним/сукцинімідним методом [207]. Нижче наведено структуру
гаптенового компоненту кон'югатів, які синтезували (рис. 2.1). Отримано
кон'югати НФ з бичачим сироватковим альбуміном (БСА), овальбуміном (ОВА) і
соєвим інгібітором трипсину (СІТ), які потім використовували в якості
імуногенів при імунізації тварин, а також при проведенні імунного аналізу.
Склад кон'югатів контролювали спектрофотометрічно.
Кон'югати білку з НФ (1) і ГГК (2)
Рис.2.1. Структура гаптенових компонентів кон’югатів.
Отримання антисироваток до НФ.
Кролів імунізували за трьома схемами, які відрізнялись по:
• типу кон’югатів (ГГК-БСА, ГГК-СІТ і НФ-БСА, НФ-СІТ), що використовували;
• концентрації кон’югату (0,1 мг/мл або 0,5 мг/мл);
• ад'юванту (повний ад'ювант Фрейнда, неповний ад'ювант Фрейнда, коклюшна
моновакцина);
• інтервалам між циклами імунізації [207, 209].
Перший цикл імунізації проводили відповідно до наступного протоколу:
1-а схема - 1,5 мл розчину імуногену (ГГК-БСА) (0,5 мг/мл) з повним ад'ювантом
Фрейнда вводили внутрішньошкірно в 8-10 точок спини і підшкірно в 2-4 точки
спини;
2-а схема - 1,5 мл розчину імуногену (ГГК-БСА) (0,1 мг/мл) з повним ад'ювантом
Фрейнда вводили в області спини внутрішньошкірно в 8-10 точок і підшкірно в 2-4
точки, а також 0,5 мл вакцини коклюшу підшкірно в 2-4 точки;
3-я схема - 1,5 мл розчину імуногену (ГГК-БСА) (0,5 мг/мл) з повним ад'ювантом
Фрейнда вводили внутрішньошкірно в 8-10 точок спини.
Подальші цикли імунізації здійснювали кон’югатами немодифікованого НФ з БСА і
СІТ, тобто тими, в яких гаптеном виступав НФ, а не ГГК. Через кожних 4 тижні
проводили 2-й і подальші цикли імунізації. Для контролю рівня антитіл кров
брали через 8 днів після введення антигену.
Антисироватки отримували, поміщаючи зразки крові в термостат на 30 хвилин при
37°С, а потім на 2 години при +4°С. Потім їх центрифугували при 3000 g протягом
15 хвилин, антисироватку розділяли на аліквоти і зберігали при -20°С.
Виділення тотальної фракції імуноглобуліну.
Для цього до 100 мл сироватки додавали 50 мл насиченого розчину сульфату
амонію. Осад видаляли центрифугуванням, розчиняли в 50 мл дистильованої води і
знову додавали 25 мл насиченого розчину сульфату амонію. Осадження повторювали
4-5 разів. Потім препарат піддавали діалізу проти натрій-фосфатного буферного
розчину (ФБР) і визначали в ньому концентрацію білку виходячи з поглинання при
л =280 нм.
2.3. Постановка імуноферментного аналізу типу ELISA
В роботі використовували непрямі „неконкурентний” та „конкурентний” варіанти
методу ELISA
„Неконкурентний” метод. Схема методу: на твердій поверхні іммобілізували
антиген, після чого додавали досліджувану антисироватку і після інкубації і
видалення компонентів, що не зв’язались, виявлення специфічних імунних
комплексів проводили за допомогою мічених ферментом „антивидових” антитіл.
Метод „конкуренції”. Схема методу: до носія, що містить іммобілізований антиген
додавали розчин, який являв собою суміш антигену, що визначався, і фіксовану
кількість антитіл. Після інкубації і видалення компонентів, що не брали участі
в утворенні специфічних імунних комплексів визначали ферментативну активність
шляхом введення в систему мічених ферментом антивидових антитіл. Ферментативна
активність була обернено пропорційною концентрації досліджуваного антигену.
Критичним фактором, що визначає успішне застосування методу ELISA, є адсорбція
антигенів (антитіл) на носії. До ефективності і відтворюваності процесу
адсорбції, що мають забезпечити високу чутливість і звести до мінімуму
неспецифічне зв’язування на наступних етапах аналізу, висуваються високі
вимоги. Зв’язування антигенів з твердим носієм проводять шляхом ,,пасивної”
адсорбції чи ,,активної” ковалентної пришивки. У випадку ,,пасивної” адсорбції
носій протягом декількох годин обробляють розчином відповідного антигену,
причому зв’язування антигену з поверхнею носія забезпечується за рахунок
гідрофобних взаємодій. Після такої обробки надлишок антигену відмивають, а
носій обробляють розчином ,,інертного” білку для попередження неспецифічної
адсорбції кон’югату.
Зв’язування білків із полістіроловим носієм безпосередньо з