Вы здесь

Антиатерогенна дія кріоконсервованної плаценти при експериментальному атеросклерозі

Автор: 
Кондаков Ігор Ігоревич
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2008
Артикул:
0408U002316
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РАЗДЕЛ 2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
При выполнении диссертационной работы были использованы аллогенная криоконсервирования плацента (АКП), аорты, фрагменты аорт и миокарда, плазма и форменные элементы крови: а) кроликов с моделью экспериментального атеросклероза; б) его спонтанным регрессом в) введением АКП на фоне развивающегося регресса экспериментального атеросклероза; г) интактных животных.

2.1. Характеристика экспериментальных животных и моделирование атеросклеротического процесса у кролей.
Материалом исследования были 28 кролей самцов породы "шиншилла", весом 3500 - 4200 г., возрастом 12 месяцев. Животные находились на холестериновой диете [121] на протяжении 180 суток. Экспериментальных животных распределили на группы: І - контроль (5 животных), ІІ - модель атеросклероза (23 животных) которые содержались в стандартных условиях вивария. После достижения пика модели (6 месяцев кормления холестерином) 23 животных ІІ группы были разделены на подгруппы: 1 - спонтанный регресс экспериментального атеросклероза (10 животных); 2 - введение АКП на фоне регресса спонтанного атеросклероза (10 животных); 3 - пик модели (3 животных).
В эксперименте использовали на протяжении 6 месяцев холестерин производства С. - Петербург, Россия, в дозе 200 мг/кг массы тела per os по схеме: 5 дней - кормление холестерином, 2 дня - отдых.
После прекращения нагрузки холестерином спонтанный регресс, а также эффекты введения АКП на фоне регресса атеросклероза, исследовали на протяжении 6 недель. На 6-м месяце эксперимента животным 2-й подгруппы были введены фрагменты АКП.
Через 6 недель после введения АКП животных 1-3 подгрупп подвергали эвтаназии в соответствии с Директивой 86/609 ЕЕС и соглашением Совета Европы ЕТS 123, все эксперименты проводились в соответствии с "Общими этическими принципами экспериментов над животными"[122], одобренными Первым национальным конгрессом по биоэтике (20 сентября 2001 г. Киев, Украина) и согласно с "Правилами использования лабораторных экспериментальных животных" (1984, приложение 4). Для проведения морфологического, гистохимического и цитологического исследования были выделены аорты, фрагменты аорт и миокарда.
Использованные в диссертационной работе материалы и методы были рассмотрены и согласованные с комиссией по биоэтики ИПКиК НАН Украины.

2.2. Биохимические методы контроля состояния липидного обмена и уровня эстрадиола в сыворотке крови экспериментальных животных.

Для контроля за развитием модели атеросклероза показатели липидного обмена исследовали через каждые 30 суток на протяжении 6 месяцев в І и ІІ группах. Определяли показатели уровня ОХС, триглицеридов (ТГ) и ХС липопротеидов высокой плотности (ЛПВП). Для исследования использовали реактивы фирмы "Lachema": для определения уровня ОХС - CHOL 150, бета-липопротеидов - BLP 200, и ТГ - TG 50. Уровень ЛПНП и липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП) определяли по формулам:
ЛПНП = ОХС - (ЛПВП + (ТГ/2,18));
ЛПОНП = ТГ/2,18.
Коэффициент атерогенности (КА) определяли по формуле:
КА = (ОХС - ЛПВП)/ ЛПВП [123].
Показатели липидного обмена на пику развития экспериментального атеросклероза при его регрессе, а также после введения АКП на фоне регресса регистрировали каждую неделю на протяжении 3-х недель.
Уровень эстрадиола в сыворотке крови животных исследовали прямым твердофазным иммуноферментным методом с использованием реактивов фирмы DRG (Estradіol Elіsa Kіt). Показатели уровня эстрадиола в сыворотке крови определяли у животных всех групп и подгрупп.
Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью программы Statgraph 2.0. При анализе использовали непараметрический критерий Уитни-Манна

2.3. Планиметрическая оценка частоты и распространенности очагов липоидоза в интиме аорты экспериментальных животных.

Аорты выделяли от дуги до бифуркации на бедренные артерии фиксировали в нейтральном 10% растворе формалина, после чего для проведения планиметрии окрашивали по методу [124].
Способ спирт-формальдегид-глицериновой окраски Суданом красным для выявления ряда липидов в клетках и тканях различных органов. Для этого необходимо:
1. Основной раствор судана IV (1 г судана IV на 100 мл 96° этилового спирта). Готовится заранее (за 7-10 дней до использования), без подогрева, при комнатной температуре, с помощью взбалтываний.
2. Раствор для тотальной окраски. Готовится по надобности. На 1 л смеси из 96° этилового спирта и водопроводной воды (по 350 мл), крепкого формалина и чистого глицерина (по 150 мл) перед окраской аорты и других органов добавляется 5-10 мл фильтрата (не более) основного раствора Судана IV.
Затем из формалина без промывки водой и спиртом аорта переносится в окрашивающий раствор. Через каждые 7-10 дней в побледневший раствор добавляется новая порция фильтрата основного раствора Судана IV. Окраска продолжается не менее 1 (лучше 2) мес. Окрашенная аорта без промывки водой и спиртом переносится для изучения и хранения в 10% раствор формалина (на водопроводной воде).
Фотосъемка аорт проводилась цифровым фотоаппаратом Olympus C 180. Подсчет процента площади очагов липоидоза проводили при помощи морфометрической программы Biovision 3.0., для этого измеряли общую площадь аорты, а затем, отдельно площадь очагов поражения. Всего исследовано 28 грудных отделов аорт.

2.4. Морфологические методы исследования морфо-функционального состояния миокарда, эндотелия аорты и лейкоцитов периферической крови экспериментальных животных
Для гистохимического исследования кусочки аорты и миокарда заливали в парафин и использовали для рутинного гистологического исследования. Полученные после парафиновой проводки гистологические срезы тканей окрашивали гематоксилин-эозином, пикрофуксином по Ван-Гизон, на элластические волокна по методу Харта, элластические волокна по Вейгерту [125]. Подсчет сосудов в миокарде проводили из расчета на ед/ мм2 (720 мкм2 поле зре