Вы здесь

Експериментальне обґрунтування імуноферментної діагностики трихінельозу тварин

Автор: 
Небещук Олександр Дмитрович
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2008
Артикул:
0408U003267
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
ЗАГАЛЬНА МЕТОДИКА І ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Експериментальну частину роботи, апробацію та виробничу перевірку результатів досліджень проводили упродовж 2003-2007 років у науковій лабораторії кафедри паразитології та фармакології Білоцерківського національного аграрного університету, кафедри вірусології, мікробіології та біотехнології Національного аграрного університету, відділі паразитології Державного науково-дослідного інституту з лабораторної діагностики та ветеринарно-санітарної експертизи, а також у відділах паразитології державних лабораторій ветеринарної медицини областей України (Київської, Миколаївської, Полтавської, Івано-Франківської, Хмельницької).
Матеріалом для досліджень був штам Тrichinella spiralis, люб'язно наданий Всеросійським інститутом гельмінтології ім. Скрябіна (ВІГІС) у рамках творчого договору та підтримувався на білих щурах; сироватки крові, отримані від експериментально заражених трихінелами свиней, собак, коней; сироватки крові тварин із господарств областей України (Київської, Миколаївської, Полтавської, Івано-Франківської, Хмельницької); позитивні та негативні щодо трихінельозу референс-сироватки, люб'язно надані доктором Е. Pozio (Іnstituto Saperiore di Sanita, Laboratorio de Parasitologia, Roma, Italy), екскреторно-секреторний антиген із личинок Т. spiralis, а також кон'югати імуноферментні на основі рекомбінантних білка А золотистого стафілокока та стрептококового білка G, кон'югованих з пероксидазою хрону.
Експериментальне зараження тварин. У дослідах з експериментального зараження трихінелами використовували трьох поросят великої білої породи віком 3 міс. середньою масою 20 кг, трьох безпорідних собак віком 1,5-2 роки масою 6-8 кг та 2 коней віком 2 роки масою 380- 400 кг, вільних від гельмінтів шлунково-кишкового каналу і антитіл проти Trichinella spiralis.
Для експериментального зараження тварин використовували фарш м'язів щурів, що містив личинки Тrichinella spiralis. Для цього проводили еутаназію щурів, на яких підтримувався штам Trichinella spiralis, із їх м'язів отримували фарш. Перед задаванням тваринам інвазійного матеріалу методом перетравлювання проб м'язів у штучному шлунковому соці підраховували кількість личинок, яка містилась в 1 г фаршу, та робили наважку фаршу для кожної тварини, що містила необхідну кількість личинок трихінел.
Тваринам задавали фарш протягом двох днів рівними частинами орально з кормом. Свині № 1 згодовували фарш, який містив 30000 екз. личинок, № 2 - 10000, свині № 3 - 5000 екз. личинок трихінел. Трьом собакам задавали по 30000 екз. личинок трихінел. Коню № 1 задавали 70000, коню № 2 - 40000 екз. личинок трихінел.
Від дослідних тварин відбирали зразки сироваток крові на 7, 14, 21, 28, 35 та 42-у доби після експериментального зараження. Отримані сироватки крові розфасовували у пробірки та зберігали за температури -20 оС.
Після закінчення експерименту проводили еутаназію тварин, а від їх туш відбирали зразки м'язів діафрагми, масетерів, язика, міжреберних, литкових і черевного пресу. Кількість личинок трихінел у пробах м'язів підраховували у 48 зрізах під компресорієм та в 1 г м'язів після перетравлювання у штучному шлунковому соці.
Компресорна трихінелоскопія. Для проведення компресорної трихінелоскопії з відібраних зразків м'язів робили 48 зрізів розміром з вівсяне зерно, клали їх у вічка нижньої пластини компресоріуму, накривали верхньою пластиною, роздавлювали зрізи так, щоб через них можна було читати газетний текст, та досліджували під проекційним трихінелоскопом "ПТ-80". Дослідження зразків м'язів кожної групи проводили триразово з наступним визначенням середньостатистичної кількості личинок у 48 зрізах.
Перетравлювання проб м'язів у штучному шлунковому соці. Для проведення перетравлювання відібраних зразків від експериментально заражених тварин шматочки м'язів звільняли від жиру, фасцій, крові і готували фарш на м'ясорубці з діаметром вічок решітки 3 мм.
Штучний шлунковий сік готували безпосередньо перед дослідженням. Для цього брали 1 л водопровідної води температурою +45±2 оС, додавали 8 см3 концентрованої соляної кислоти та 3 г пепсину (Merck). Виготовлений штучний шлунковий сік виливали у хімічний стакан з плоским дном і додавали фарш. На 100 см3 штучного шлункового соку брали 5 г фаршу. Суміш ставили на магнітну мішалку з підігрівом і проводили перетравлювання за температури +45±2 оС з експозицією 30 хв.
Після закінчення перетравлювання вміст фільтрували через сито з діаметром вічок 300-400 мкм, зафіксоване у лійці з краником. Фільтрат у лійці відстоювали 30 хв для осаду личинок. Потім відбирали 40 см3 осаду у мірний стакан і відстоювали 15 хв, після чого 30 см3 надосадової рідини обережно зливали, а осад виливали у бактеріологічну чашку і досліджували під проекційним трихінелоскопом. Кількість личинок трихінел в 1 г м'язів визначали поділом загальної кількості личинок у пробі на масу проби. Зразки кожної групи м'язів досліджували у трьох повторах, після чого визначали середньостатистичну кількість личинок 1 г м'язів.
Виготовлення антигену. У процесі розробки тест-системи, як антиген використовували соматичний екстракт личинок T. spiralis першої стадії (ML-1) та екскреторно-секреторні продукти, отримані під час культивування личинок T. spiralis першої стадії in vitro.
Соматичний антиген личинок T. spiralis готували за методикою L.R. Melcher (1943), описаною А.С. Бессоновим [249], у нашій модифікації. Для цього личинок трихінел виділяли методом перетравлювання у штучному шлунковому соці з м'язів щурів, експериментально заражених личинками T. spiralis. Личинки триразово відмивали в стерильному ізотонічному розчині NaCl. Підраховували їх концентрацію в 1 см3. 4 см3 суспензії відмитих личинок у кількості 50000/1 см3 ізотонічного розчину NaCl поміщали у флакон об'ємом 20 см3, додавали для знежирювання 4 см3 петролейного ефіру, закривали пробкою і ставили на шейкер в термостат при