Вы здесь

Взаємозв’язок морфогенезу кісткового скелета з органами імунної системи при імуностимуляції та імуносупресії в онтогенезі (анатомо-експериментальне дослідження).

Автор: 
Кащенко Світлана Аркадіївна
Тип работы: 
Дис. докт. наук
Год: 
2004
Артикул:
0504U000626
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проведено на 845 белых крысах - самцах различных возрастных групп, полученных из вивария лабораторных животных Луганского государственного медицинского университета. Распределение материала по сериям и группам представлено в таблицах 2.1 и 2.2. При выборе животных принимались во внимание следующие особенности: 1) - крысы имеют сравнительно непродолжительный цикл жизни при непрерывном ростовом процессе костей скелета, высокой скорости обменных реакций, что позволяет в течение небольшого временного интервала проследить возрастные закономерности морфогенеза костей [84]; 2) - лимфоидная система крыс отличается низким полиморфизмом генов главного комплекса гистосовместимости, слабой реактивностью в отношении В-клеточных митогенов, повышенной активностью А-клеток [101].
Эксперимент проводился в осенне-зимний период года. При работе с экспериментальными животными руководствовались "Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, которые используются в экспериментальных и других научных целях" (Страсбург, 18.03.86 г.) [375]. До и во время эксперимента крысы находились в виварии при t° 20-25 C, влажности не более 50%, объёме воздухообмена (вытяжка-приток) 8:10, в световом режиме день-ночь, в стандартных пластиковых клетках (не более 6 особей в каждой), на стандартном рационе. Проводилось ежедневное наблюдение за поведением и общим состоянием животных. Все крысы, используемые в эксперименте, были здоровы и активны, имели опрятный вид. При выполнении операций на животных соблюдались принципы гуманного к ним отношения, асептики, обезболивания, послеоперационного ухода [100, 319].
Проведено семь серий опытов. Первые четыре серии посвящены исследованию влияния тимэктомии, введения тимогена, циклофосфана и циклоферона на морфогенез костей скелета и органов иммунной системы животных различных возрастных групп. Пятая серия исследования была посвящена изучению влияния тимэктомии, введению циклофосфана, циклоферона и тимогена на эмбриональный остеогенез у потомства. Шестую серию составили самки и самцы, от которых получали потомство для изучения особенностей течения эмбрионального остеогенеза и остеогенеза в раннем постнатальном периоде. В седьмой серии проведено электронномикроскопическое изучение тимуса половозрелых крыс при разных условиях эксперимента.
В каждой серии животные были распределены на группы в зависимости от продолжительности наблюдения. Контролем для тимэктомированных животных служили ложнооперирванные самцы, которым проводились все этапы операции, кроме удаления тимуса. Полноту удаления тимуса оценивали визуально и гистологическим методом. При выявлении животных с остаточным тимусом их исключали из эксперимента. Контролем для остальных групп животных служили крысы, которым вводили физиологический раствор в эквивалентных объёмах.
Кровь для иммунологического анализа получали в асептических условиях из хвостовой вены животных непосредственно перед забоем, для предотвращения свертывания добавляли гепарин (в количестве 20 ед. на 1 мл крови). Сыворотку приготавливали путём центрифугирования при 800g, разливали в герметичные пластиковые пробирки "Eppendorf" (Германия) и замораживали при температуре -20°С. Оценку иммунологической реактивности животных производили с помощью лабораторного теста, который включал определение Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана [407]. Исследование теофиллинрезистентных (ТФР-РОК) и теофиллинчувствительных (ТФЧ-РОК) розеткообразущих клеток призводилось по Limantibul F. [422], вычислялось соотношение ТФР/ТФЧ. Подсчет "активных" розеткообразующих клеток Е-розеткообразующих клеток (Е-РОК), активных (Еакт-РОК), термостабильных (С-РОК), ауторозеткообразующих (ауто-РОК) производили no методу Florey M., Peetom F. (1976) [380]. Подсчитывали число 0-клеток, "неполных" розеток-комплексов лимфоцитов с 1 или 2 эритроцитами барана (ЭБ) при постановке реакции Е-розеткообразования, а также количество многорецепторных РОК-с 9 ЭБ и более. Определение числа В-лимфоцитов производилось методом спонтанного розеткообразования в присутствии папаина [498].
Регуляторно-метаболический профиль организма определяли с помощью биохимических методов. В сыворотке животных определяли количество фосфора, кальция, натрия, хлора, калия, щелочной фосфатазы, кортизола, трийодтиронина, тироксина [56, 96, 198]. Все биохимические реакции выполнены на биохимическом полуавтоматическом анализаторе Польской фирмы "Cormay Multi" №801260337. В эксперименте были использованы реактивы и контрольные сыворотки HUMAN.
Содержание хлоридов определяли с помощью колориметрического метода комплексообразования. Калий выявляли с помощью фотометрического турбидиметрического метода. Натрий определяли фотометрическим способом с помощью Mg уранилацетатного колориметрического теста (Indotest(r) 573 371). Кальций, неорганический фосфат (без протеинирования, VIS - вариант), активность щелочной фосфатазы, выявляли фотометрическим методом. Гормональная активность щитовидной железы оценивалась по уровню содержания трийодтиронина и тетрайодтиронина (тироксина) в сыворотке крыс методом твёрдофазного иммуноферментного анализа. Об участии коры надпочечников в эндокринной регуляции иммуногенеза судили по уровню кортизола в сыворотке животных. Кортизол выявляли с помощью теста "Elisa" (HUMAREADER) колориметрическим способом.
Иммуносупрессивное состояние у животных моделировали путём введения циклофосфана и оперативным удалением тимуса.
Расчёт дозировки всех вводимых лекарственных препаратов производили с учётом рекомендаций Ю.Р. и Р.С.Рыболовлевых [244], которые при использовании лекарственных веществ в эксперименте на животных, рекомендуют учитывать константу биологической активности при дозировании веществ в работе с млекопитающими. Использование данной рекомендации основано на особенностях видовых различий, зависящих от основного обмена, массы тела, площади поверхности тела, интенсивности сердечно