Вы здесь

Гематологічні механізми хронізації запалення.

Автор: 
Шевченко Олександр Миколайович
Тип работы: 
Дис. докт. наук
Год: 
2006
Артикул:
0506U000081
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

ГЛАВА 2
ОБЩАЯ МЕТОДИКА И ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальные исследования выполнены на 246 крысах-самцах Wistar массой
180-200г (табл.2.1). Крысы наиболее часто используются для моделирования
воспалительных процессов.
Таблица 2.1
Распределение животных по сериям эксперимента в соответствии с задачами
исследования
№ п/п
Серии экспериментов
Количество животных
1.
Реакции системы крови при остром инфекционном воспалении
66
2.
Реакции системы крови при карагиненовом асептическом воспалении
66
3.
Реакции системы крови при хроническом асептическом гранулематозном воспалении
66
4.
Реакции системы крови при хроническом иммунном воспалении
66
Содержание животных и способ их умерщвления. Подопытных животных выдерживали на
обычном пищевом рационе со свободным доступом к воде по 10-12 особей в
стандартных металлических клетках. Для исключения влияния сезонных и суточных
колебаний на изучаемые показатели основные исследования были проведены в
осенне-зимний период, в утренние часы. Опыты осуществляли в соответствии с
национальными «Общими этическими принципами опытов на животных» (Украина,
2001), которые согласуются с положениями «Европейской конвенции о защите
позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других
научных целей» (Страсбург, 18.03.1986 г.). Умерщвление животных проводили путем
декапитации под эфирным наркозом. В качестве материала исследований
использовали ткани очага воспаления, костный мозг бедра, периферическую кровь.
Воспроизведение воспаления. Моделями воспаления служили: острое инфекционное
воспаление, воспроизведенное внутримышечным введением 2 млрд микробных тел
Stарhуlососсus aureus, штамм АТСС-25923, в 1 мл изотонического раствора хлорида
натрия [343], карагиненовое асептическое воспаление, вызванное подкожным
введением 5 мг л-карагинена (Sigma, США) в 1 мл изотонического раствора хлорида
натрия [344] и охарактеризованное нами как вторично хроническое (см. главу № 3)
асептическое гранулематозное воспаление, воспроизведенное подкожным введением
сефадекса А-25 в дозе 1 мг в 1 мл изотонического раствора хлорида натрия [345],
хроническое иммунное воспаление типа адьювантного артрита, вызванное введением
в субплантарный апоневроз полного адьюванта Фрейнда в дозе 0,1 мл [9]. Модели
воспаления характеризовали путем изучения его основного показателя –
клеточно-тканевой динамики очага.
Клеточно-тканевую динамику очага воспаления исследовали на парафиновых срезах
толщиной 5-6 мкм с помощью обзорной окраски гематоксилином-эозином, по ван
Гизону (выявление коллагенизации), ШИК + альциановим синим (дифференцирование
основных и кислых гликозаминогликанов), галоцианином по Эйнарсону (выявление
общих нуклеинових кислот) [346].
В подробной динамике воспаления, начиная с 6-го ч до 28-х сут, исследовали
реакции системы крови: клеточный состав и экспрессию адгезивных молекул очага
воспаления, костномозговое кроветворение, клеточный состав и
иммуногистохимические реакции костного мозга, лейкоцитарную реакцию и
функциональную активность лейкоцитов периферической крови, содержание в
периферической крови Г-КСФ и ГМ-КСФ.
Клеточный состав очага воспаления определяли путем подсчета количества
нейтрофилов, эозинофилов, лимфоцитов, моноцитов, макрофагов, тканевых
базофилов, фибробластов, плазматических и эпителиоидных клеток в
гистологических препаратах при окраске гематоксилином-эозином [346].
Экспрессию адгезивных молекул очага воспаления исследовали иммуногистохимически
непрямым методом Кунса по методике Brosman [347] на идентичных гистологических
препаратах, используя наборы люминисцентных моноклональных антител к
поверхностным антигенам клеток крыс, производства фирмы «SEROTEC»,
Великобритания. Определяли экспрессию CD54 – адгезии лейкоцитов; CD44 - НГ;
CD11с – клеток миелоидного ряда; CD31 - моноцитов, гранулоцитов, В-лимфоцитов,
эндотелиальных клеток; CD61- макрофагов, тромбоцитов и их предшественников.
Костномозговое кроветворение изучали путем подсчета общего количества
миелокариоцитов.
Для получения костного мозга выделяли бедренную кость крысы, очищали её от
мягких тканей и тщательно промывали канал 1 мл 3% уксусной кислоты
(подкрашенной генцианвиолетом). Костный мозг суспендировали, набирали в
меланжер для белой крови и разводили 3% уксусной кислотой. Подсчет общего
количества миелокариоцитов на бедро осуществляли с помощью камеры Горяева
[348].
Клеточный состав костного мозга исследовали в миелограмме и на гистологических
парафиновых срезах костного мозга из бедренной кости. Для приготовления мазков
костного мозга, его выдавливали из дистального конца бедренной кости на
обезжиренное стекло и разводили изологической сывороткой. Мазки фиксировали в
метаноле и окрашивали азуром II-эозином по методу Романовского – Гимза [348].
Гистологические парафиновые срезы костного мозга из бедренной кости окрашивали
по методу Папенгейма [346] и просматривали в световом поле микроскопа, х400.
Иммуногистохимические реакции костного мозга исследовали, используя наборы
люминисцентных моноклональных антител к поверхностным антигенам клеток
гематологического ряда крыс, производства фирмы «SEROTEC», Великобритания. На
гистологических препаратах костного мозга определяли: экспрессию CD43
миелоидных клеток и Т-лимфоцитов; CD11b - клеток нейтрофильного и моноцитарного
ряда; CD11с – клеток моноцитарного ряда; CD3- Т-лимфоцитов и их
предшественников; CD4 - Т-лимфоцитов (хелперов); CD25 - активированных Т- и
В-лимфоцитов; CD45RA - В-лимфоцитов разной степени зрелости; CD61- макрофагов,
тромбоцитов и их