Вы здесь

Теоретичні та практичні аспекти виготовлення гіперімунних сироваток (на моделі вірусів хвороби Ауєскі, геморагічної хвороби кролів і чуми м'ясоїдних)

Автор: 
Корнієнко Леонід Євгенович
Тип работы: 
Дис. докт. наук
Год: 
2006
Артикул:
0506U000545
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
ВИБІР НАПРЯМІВ ДОСЛІДЖЕНЬ,
МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ВИКОНАННЯ РОБОТИ
Робота виконувалась у 1992 року в лабораторії біотехнології клітинних культур
Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини, з 1993 по 2004
рік – на базі науково-дослідної лабораторії кафедри епізоотології та
інфекційних хвороб Білоцерківського державного аграрного університету,
навчальному господарстві Білоцерківського державного аграрного університету,
індивідуальних господарствах кролівників-любителів Володарського й
Білоцерківського районів Київської області, Білоцерківського міського
підприємства державної ветеринарної медицини, Остерській дільничній лікарні
ветеринарної медицини Чернігівської області. Сироватки моновалентні (проти
чуми) і полівалентні (проти чуми, парвовірозу та інфекційного гепатиту)
реалізувались через державне підприємство “Укрзооветпромпостач” (м. Бровари) і
випробовувались в усіх областях України. Досліди з імунізації свиней живим
вірусом хвороби Ауєскі проводились у ВНДЯІ.
У дослідах були використані штами вірусу хвороби Ауєскі “УНДІЕВ-18ВС”, “К”;
вірулентний штам вірусу чуми м’ясоїдних, виділений нами у 1992 р. і типований
із специфічними моновалентними сироватками “Rhone Meriux”, також вакцинний штам
“ЕПМ”; епізоотичний штам “Воронезький-87” та виділений нами вірулентний “НК/99”
(типований і паспортизований) вірусу геморагічної хвороби кролів.
Культивування вірусів та напрацювання вірусовмісної сировини здійснювали на
первинних та перещеплюваних культурах клітин. Зокрема, вірус хвороби Ауєскі
культивували на перещеплюваних клітинах гонад кози (GН-91), первинній культурі
клітин курячих фібробластів; вірус чуми м’ясоїдних – на перещеплюваних
культурах клітин ВНК-21, ПТП та КФ. Культури клітин ВНК-21 та GH-91 отримували
в ІЕКВМ (м. Харків), культуру клітин

ПТП в ІВМ (м. Київ). Первинну культуру клітин курячих фібробластів (КФ)
готували за загальноприйнятою методикою з використанням диспергуючих ферментів
[192].
В дослідах з культурами клітин використовували живильні середовища Інституту
поліомієліту і вірусних енцефаломієлітів (м. Москва) та Інституту ветеринарної
медицини (м. Київ) з додаванням сироватки крові великої рогатої худоби
виробництва Київського та Херсонського м’ясокомбінатів. Концентрація водневих
іонів у середовищах при культивуванні клітин та вірусу становила 7,0–7,2.
Корекцію величини рН середовища здійснювали за допомогою стерильного
комерційного 7,5% розчину натрію двовуглекислого. З метою вивчення найбільш
оптимальної дози зараження випробувано від 0,1 до 0,02 ТЦД50 ЦПО (цитопатичних
одиниць) з розрахунку на одну клітину.
Клітинні культури та вірус культивували у флаконах із під пеніциліну і
культуральних колбах об’ємом 1,2–1,5 літра, заповнених середовищем на 10–15%
від їхнього об’єму. Зараження культури вірусами здійснювали після зливання
ростового середовища і ополіскування моношару розчином Хенкса. Після годинного
контакту вірусовмісну рідину зливали й заливали клітинний моношар
підтримувальним середовищем. В якості контролю брали неінфіковану культуру з
підтримувальним середовищем. Культивування здійснювали в термостаті при
37±0,5оС. Інкубування клітин і вірусу припиняли за наявності 65–85% уражених
клітин, термін якої для вірусу хвороби Ауєскі становив 24–72 год, для вірусу
чуми м’ясоїдних 3–12 діб. Вірусовмісні суспензії перевіряли на стерильність.
Активність вихідних вірусних суспензій переважно визначали за титрами
інфекційності на гомологічних культурах. Титри інфекційності вираховували за
методом Кербера у модифікації И.П. Ашмарина, А.А. Воробьева (1962) у lg
ТЦД50/см3 [289].
Очищення вірусовмісних суспензій від клітинного детриту здійснювали методом
відстоювання і центрифугування із застосуванням аеросилу й поліетиленгліколю.
Баластні речовини із сироваток видаляли методом відстоювання й центрифугування,
із застосуванням розчинів аеросилу, поліетиленгліколю, дезмолу, формаліну.
Ступінь очищення вірусовмісних суспензій визначали за зниженням кількості білка
в пробі спектрофотометричним методом при довжині хвилі 280 нм (Холин Ю.А. и
соавт., 1981) і за методом O.H. Lowry et al. (1951) (цитується за Н.С.
Мамковим, 1999) [182].
Концентрування вірусу хвороби Ауєскі для гіперімунізації тварин здійснювали за
раніше відпрацьованими методиками [154]. Концентрування вірусів чуми м’ясоїдних
і геморагічної хвороби кролів здійснювали поліетиленгліколем. З цією метою
вірусовмісну суспензію освітлювали центрифугуванням при 4–10оС. У надосадову
рідину вносили NaCl до кінцевої концентрації 0,5М і після перемішування
додавали стерильний 50% розчин ПЕГ до кінцевих концентрацій 4–12%. Концентрацію
водневих іонів вірусовмісних суспензій корегували 5М розчином аміаку або
глікоколового буферу до 7,4–7,6. Суміш інкубували 4–48 год при температурі
2–4оС. Після цього преципітат осаджували центрифугуванням при температурі
4–10оС. Осад ресуспендували від 1/10 до 1/100 вихідного об’єму вірусовмісної
суспензії із застосуванням 0,1М аміачного буферного розчину, рН 7,4–7,6. Після
ресуспендування досліджувану суспензію освітлювали шляхом центрифугування.
Надосадову рідину використовували у наступних дослідах. Ефективність
концентрування суспензій вірусу геморагічної хвороби кролів визначали за
активністю вірусу в РГА та РЗК. У вихідній вірусовмісній культуральній рідині,
концентратах і надосадовій рідині визначали титр інфекційності вірусу чуми
м’ясоїдних. Процент втрат вірусу розраховували за формулою (титри інфекційної
активності вірусу визначали у абсолютних значеннях):
Втрати віру