Вы здесь

Молекулярні механізми перенесення сигналів регуляторів функції кори надниркових залоз

Автор: 
Ковзун Олена Ігорівна
Тип работы: 
Дис. докт. наук
Год: 
2008
Артикул:
0508U000181
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
2.1. Об’єкт досліджень
Більшість експериментів проведено на тканинах пухлин надниркових залоз хворих,
прооперованих в клініці інституту (119 хворих). Верифікація типу пухлин
проводилась у патоморфологічному відділенні інституту. Отримано тканину від
хворих з такою патологією: аденома кори надниркових залоз
(гормонально-неактивна (28 зразків), гормонально-активна: кортикостерома (29
зразків), альдостерома (12 зразків), андростерома (3 зразки)), карцинома кори
надниркових залоз (11 зразків), хвороба Іценка-Кушинга (24 зразки) (рис.
2.1-2.5). Використовували також ділянки візуально незміненої тканини кори
надниркових залоз (умовно нормальна тканина), всього 71 зразок (рис. 2.6).
В роботі були використані експериментальні тварини (всього 305 тварин) – самки
та самці (інтактні та орхіектомовані) щурів лінії Вістар масою 200-250 г, самці
морських свинок масою 350-550 г, а також первинні культури надниркових залоз
новонароджених поросят.
На проведення досліджень було отримано дозвіл комітету Інституту з біоетики.
Отримання клінічного матеріалу здійснювалось з дотриманням етичних норм та
згідно чинним процедурам.
Експерименти in vitro
Зрізи очищеної кори надниркових залоз щурів або людини вагою 20-200 мг (в
залежності від умов експерименту) інкубували в 1 мл середовища 199 (Державний
завод медичних препаратів, Україна), що містило 20 мМ HEPES (pH 7,4)
("Calbiochem", США) та 2 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну ("Serva",
Німеччина) при 37 °С та постійному струшуванні.
331
Рис. 2.1. Гормонально-неактивна аденома кори надниркових залоз людини.
Забарвлення гематоксилін-еозином.
331
Рис. 2.2. Гормонально-активна аденома кори надниркових залоз людини.
Забарвлення гематоксилін-еозином.
331
Рис. 2.3. Карцинома кори надниркових залоз людини. Забарвлення
гематоксилін-еозином.
1 – зони некрозу, 2 – мітози.
331
Рис. 2.4. Карцинома кори надниркових залоз людини. Забарвлення
гематоксилін-еозином.
1 – інвазія пухлинних клітин до судини.
331
Рис. 2.5. Гіперплазована тканина кори надниркових залоз людини (хвороба
Іценка-Кушинга). Забарвлення гематоксилін-еозином.
331
Рис. 2.6 Візуально незмінена (умовно нормальна) тканина кори надниркових залоз
людини. Забарвлення гематоксилін-еозином.
До середовища інкубації додавали: 1) АКТГ (Кортикотропін А, "Sigma", США) з
розрахунку 0,2 та 2 од. на 100 мг тканини. Проби інкубували протягом 1 год; 2)
спиртовий розчин 17b-естрадіолу ("Кoch-Ligth", Велика Британія) в кінцевій
концентрації 10-9 - 10-4 М. В контрольні проби додавали відповідну кількість
спирту. Час інкубації тривав від 30 хв до 4 год; 3) спиртовий розчин препарату
NAE – суміші N-ацилетаноламінів в кінцевій концентрації 0,3 – 33 мкг/мл, або
стеароїлетаноламіну (NAE18:0) в кінцевій концентрації 10-7 – 10-4 М. Речовини
було синтезовано в Інституті біології моря (Владивосток, Російська Федерація).
Суміш N-ацилетаноламінів більш ніж на 60 % складали ацили ненасичених жирних
кислот: 6,3 % арахідонової, 1,8 % лінолевої, 7,6 % гондової, 18,4 % олеїнової,
6,4 % пальмітоолеїнової, 16,7 % ейкозапентаенової, 2,7 % докозагексаенової;
близько 30 % – ацили насичених жирних кислот: 6,4 % міристинової, 22,4 %
пальмітинової, 3,0 % стеаринової, 1,0 % арахінової, 1,4 % бегенової.
Газохроматографічний аналіз складу суміші NAE наведено на рис. 2.7. Контрольні
проби містили розчинник у відповідній концентрації. Термін інкубації – 2 год;
4) дофамін в кінцевій концентрації 10-7 – 10-5 М. Час інкубації тривав 2 год;
5) KCl (Merck, Німеччина) в кінцевій концентрації 3,5 та 8,5мМ. Проби
інкубували протягом 30 хв. Буфер для інкубації містив 10 мМ Na2HPO4, 1 мM
Na3PO4, 130 мM NaCl, 1,27 мM MgSO4, 2 мM CaCl2, 20 мM HEPES (рН 7,4), 2 мг/мл
БСА. Для вивчення стероїдогенезу зрізи кори надниркових залоз щурів інкубували
з 3Н-холестерином ("Ізотоп", Російська Федерація) (кінцева концентрація 25
мккюрі), екстрагували стероїди, які фракціонували методом двомірної
тонкошарової хроматографії, визначали радіоактивність продуктів мічення. Для
характеристики метаболізму фосфатидилхоліну до контрольних та дослідних
суспензій клітин кори надниркових залоз морських свинок додавали 3Н-холін
("Amersham", Велика Британія, 15 кюрі/ммоль) до кінцевої концентрації 5
мккюрі/мл.
Рис. 2.7. Результати газової хроматографії суміші NAE.
Експерименти in vivo
Роботу виконано на інтактних щурах-самцях, розділених на 3 експериментальні
групи: контрольні тварини, яким вводили фізіологічний розчин, тварини, що
одноразово отримували АКТГ (Кортикотропін А, "Sigma", США, 2 од./100 г маси
тіла). Тварин декапітували через 1 год або 6 год після ін’єкції.
Частину експериментів виконано на кастрованих дорослих самцях щурів.
Орхіектомію здійснювали під ефірним наркозом. В експериментах тварин
використовували через 4 тижні після кастрації. Використовували такі
експериментальні групи: інтактні тварини, яким вводили сливову олію, інтактні
тварини, що отримували естрадіол (естрадіол бензоат "Кoch-Light", Велика
Британія, розчинений у сливовій олії, у дозі 50 або 100 мкг/тварину протягом
трьох діб), орхіектомовані тварини, орхіектомовані, що отримували естрадіол.
Тварин декапітували через добу після останньої ін’єкції під етаміналовим
наркозом (4 мг/100 г маси тіла). Відомо, що введення етаміналу не впливає на
продукцію кортикостероїдів в корі надниркових залоз. Кров індивідуальних тварин
збирали у пробірки з гепарином (ЗАТ "Індар", Україна), отримували плазму
центрифугуванням при 2000 g 10 хв.
Дл