Вы здесь

Антитіла молока і сироватки крові людини: характеристика каталітичної активності та вплив на ріст і виживання клітин

Автор: 
Кіт Юрій Ярославович
Тип работы: 
Дис. докт. наук
Год: 
2008
Артикул:
0508U000435
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали дослідження
У дисертаційній роботі використано такі ізотопи: Н332РО4 (4625 Кі/моль),
[g-32P]ATP (5000 Ki/ммоль) (усі ізотопи виробництва “Ізотоп”, Російська
Федерація).
У роботі використано наступні сорбенти: Protein G- agarose Fast Flow, Protein
А- agarose Fast Flow ( “Sigma”, США); Fractogel TSK DEAE-650 (M), Fractogel TSK
HW-55 F, Kieselgel 60 (“Merck”, Німеччина); activated CH-Sepharose 4B (“Sigma”,
США); ДНК-целюлоза (1000 од. А260 на 1 г сорбенту), (НИКТИ БАВ, Російська
Федерація); BrCN-сефароза 4В (“Serva”, Німеччина).
Для виконання роботи використано наступні реактиви: РНКаза А; кон’югат Рrotein
A-HRP; лактоальбумін людини, протеїназ К, ДНК тимусу теляти ДНК і сумарна тРНК
E.coli (“Sigmа”, США); лізоцим, рестриктаза Eco R1, плазмідна ДНК (“Fermentas”,
Литва), рекомбінантний розчинний рецептор CD4 (rsCD4), (“Genentech”, США);
гепарин (”Spofa”, Чехія).
Препарати гістонів із тимусу теляти люб’язно надано д.б.н. Луциком М. Д.
(Інститут біології клітини НАН України), сумарну РНК очищено із клітин
аденокарциноми лінії А549 О. Федоренко (Інститут біології клітини НАН
України).
В роботі також використовували поліклональні моноспецифічні сироватки кроля до
важких ланцюгів імуноглобулінів людини ізотипів IgA, IgM та IgG (НІІ
епідеміології і мікробіології РАМН, Російська Федерація), IgG кроля до
Н-ланцюгів IgA людини, IgG кози до IgG людини, кон’юговані із пероксидазою
хрону (“Sigma”, США).
Сироватки крові здорових донорів і хворих на аутоімунні захворювання надано у
плані співпраці д. м. н. Негрич Т. І. (Львівський національний медичний
університет ім. Данила Галицького).
Молозиво породіль надано для проведення сумісних робіт Янів Л. Б. (Львівський
обласний перинатальний центр МОЗ України).
Спинномозкову рідину людини надано у плані наукової співпраці Окружним
військовим госпіталем № 333 (Новосибірськ, Російська Федерація).
2.2. Препаративні методи
Анти-IgA, анти-IgM та анти-IgG - антитіла очищали із кролячих антисироваток,
специфічних до імуноглобулінів людини хроматографією на колонці із протеїн
А-агарозою та імобілізували на активовану BrCN-сефарозу 4В згідно протоколу
фірми-виробника.
АТР-сефароза синтезовано шляхом імобілізації (8-амінооктил)-g-аміду АТР
(NH-(CH-)g-NH-pppA] на активовану BrCN-сефарозу к. б. н. Семеновим Д. В.
(Інститут хімічної біології і фундаментальної медицини СВ РАН).
Гепарин-сефарозу та гістон Н1-сефарозу отримували імобілізацією гепарину та
гістону Н1 відповідно на активовану CH-Sepharose 4B згідно протоколу
фірми-виробника.
Казеїн із коровячого і жіночого молока виділяли згідно методики [14].
2.3. Об’єкт експериментальних досліджень
Об’єктом досліджень були препарати різних ізотопів антитіл із різною антигенною
специфічністю, виділені із сироватки крові, молока і молозива клінічно здорових
людей, а також із сироватки крові хворих на СЧВ та РС.
2.3.1. Отримання препаратів сумарних імуноглобулінів із сироватки крові і
молока людини. Препарати сумарних імуноглобулінів отримували триразовим
переосадженням білків сироватки крові людини 50 % сульфатом амонію. Для цього,
до 0,5 мл сироватки добавляли рівний об’єм насиченого розчину сульфату амонію і
фракцію антитіл осаджували центрифугуванням при 2000 g 10 хв. Осад розчиняли в
250 мкл води, осадження повторювали два рази, після чого антитіла діалізували
проти ЗФР (10 мМ Na2HPO4/NaН2PO4, 0,14 М NaCl) протягом 18 годин. Концентрацію
білка в препаратах визначали за Бредфордом [234] і білки аналізували
електрофорезом у градієнті концентрації ПААГ (6 – 17,5 %) у присутності 0,1 %
Ds-Na [235]. До препаратів антитіл добавляли гліцерин (до 20 %) і зберігали при
-20 °С.
2.3.2. Отримання електрофоретично гомогенних препаратів антитіл із сироватки
крові і молока людини. Отримання електрофоретично гомогенних препаратів антитіл
є однією із найбільш важливих умов дослідження функціональної активності
ауто-АТ. Особливо це стосується каталітично активних антитіл, які володіють
аналогічною із ензимами каталітичною активністю. Виділення і очистка абзимів є
досить складним завданням. Це пов’язано із сукупністю факторів. Відомо, що
сумарні препарати імуноглобулінів являються поліклональними, складаються із
різноманітних за ізотипом антитіл, що мають спорідненість до великої кількості
різноманітних антигенів, серед яких є і ферменти. Останні можуть знаходитися у
комплексі із АТ і через це бути причиною артефактів при дослідженні їхньої
каталітичної активності. При очистці аут-АТ на перших стадіях необхідно
відділити антитіла від різноманітних антигенів (білків, ферментів і т.д.).
Наступним кроком необхідно отримати фракцію АТ, яка володіє спорідненістю до АГ
- потенційного субстрату каталітичної реакції. Для дослідження абзимів
оптимально було б також відділити фракцію абзимів від каталітично неактивних
антитіл.
Розроблені методи очистки абзимів дозволяють виконати всі вищеописані вимоги за
винятком останньої. На сьогодні не існує методів, які б дозволили б розділити
каталітично активні і каталітично неактивні антитіла. Оскільки за підрахунками
деяких авторів, вміст абзимів у фракціях антитіл, що мають спорідненість до
певного ліганда, наприклад ДНК, складає 1-5% [161], то очевидно, що вимірюване
значення рівня каталітичної активності антитіл є сильно занижене. Нижче
наведена узагальнена схема очистки абзимів із сироватки крові та молока людини
(рис. 2.1). Як правило, на першій стадії очистки імуноглобуліни осаджують 50 %
сульфатом амонію. Це дозволяє відділити фракцію імуноглобулінів від мажорних
білків сироватки крові чи молока. Наступна стадія включає афінну хроматограф