Вы здесь

Окисно-відновні процеси в статевих клітинах бугаїв і корів, способи оцінювання якості та підвищення запліднюваності.

Автор: 
Остапів Дмитро Дмитрович
Тип работы: 
Дис. докт. наук
Год: 
2008
Артикул:
3508U000446
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження з теми дисертаційної роботи проведені протягом 1994 - 2005 років в
Інституті землеробства і тваринництва західного регіону УААН, Інституті
біології тварин УААН, Львівському, Сокальському, Судово-Вишнянському,
Дрогобицькому племпідприємствах, м'ясопереробних підприємствах: „Прикарпаття”
та „Галев-Ресурс”. Загальна схема досліджень наведена на рис. 2.1.
З метою забезпечення інтенсивного відтворення поголів’я великої рогатої худоби,
розроблення методів оцінки якості сперміїв і ооцитів, їх відбору і корекції
метаболізму, підвищення запліднювальної здатності сперми та запліднюваності
ооцитів in vivo та in vitro проводили дослідження фізіологічних показників
якості, інтенсивності окисно-відновних процесів у статевих клітинах бугаїв і
корів у природних та штучних середовищах.
2.1. Фізіологічна характеристика еякулятів і сперміїв бугаїв та яєчників корів
Досліджували сперму бугаїв різної селекції, всього 72 плідники у віці 2-9 років
(табл. 2. 1.; характеристику бугаїв див. додаток А.)
Таблиця 2. 1
Характеристика піддослідних бугаїв
Порода
Кількість бугаїв, гол.
Вік, роки
2-3
4-5
6-9
Українська чорно-ряба молочна
17
Голштинська чорно-ряба
Німецька чорно-ряба
30
19
Голландська чорно-ряба
12
Британо-фризька

Рис. 2.1. Схема досліджень
Сперму отримували на штучну вагіну з режимом використання бугаїв дуплетна садка
два рази на тиждень. Для забезпечення вірогідності та об’ктивності результатів
дослідження проводили систематично, з інтервалом 10-14 днів. Визначали: у
свіжоотриманій спермі - об’єм еякуляту (мл), активність (рухливість) статевих
клітин (бали), концентрацію за допомогою фотоелектроколориметра (109/мл),
кількість живих сперміїв (%) підрахунком у мазках зафарбованих еозин-нігрозином
[18, 109], резистентність сперміїв (тис.), виживання у свіжоотриманих еякулятах
при температурі + 46,50С піcля розбавлення 1:10 розріджувачем для заморожування
сперми в облицьованих гранулах; у розмороженій спермі - резистентність (тис) і
виживання сперміїв (хв) до припинення прямолінійного поступального руху при
температурі + 38,00С [91]. Заморожування і розморожування проб сперми проводили
згідно інструкції та технологічного режиму племпідприємства.
Показники інтенсивності окисно-відновних процесів у спермі: активність
сукцинатдегідрогенази (СДГ; мкМ/хв/л) [101, 103]; активність цитохромоксидази
(ЦХО; мкМ/хв/л) з використанням реактиву "наді" [3, 101]; вміст аскорбінової
кислоти та продуктів окиснення (дегідроаскорбінової і дикетогулонової кислот;
мкг/мл) [22], дихальну активність – полярографічно (нг-атом О/0,1мл суспензії
сперміїв (СС) за хв) у термостатованій комірці (температура + 38,5°С) об’ємом
1,0 мл з автоматичною реєстрацією перебігу процесу самопишучими потенціометрами
КСП-2; відновну активність - потенціометрично (фериціанід калію – 10-4М; мкг
перетвореного Кз[Fe(СN)6]/ 0,1мл СС за хв.; мкг Кз .../0,1мл СС за хв) з
використанням системи відкритих мікроелектродів, які вставляли в термостатовану
полярографічну комірку [1]. Дослідження інтенсивності дихання сперми та
сперміїв придатка сім’яника проводили при температурі + 38,50C у фосфатно –
сольовому буфері (ФСБ; NaCl–0,8г, KCl–0,02г, Na2HPO4– 0,11г, KH2PO4–0,02г,
MgCl2–0,01г, Н2О до 100 мл).
2.2. Дихальна і відновна активність сперміїв бугаїв при капацитації сперміїв
Спермії з придатка сім’яника отримували після забою бугаїв і видалення
сім’яників шляхом надрізу стінки каналу придатка з наступним вимиванням
сперміїв 2,8% -ним розчином натрію цитрату або 0,9% -ним натрію хлориду. У
суспензії сперміїв визначали кількість статевих клітин (109/мл) підрахунком в
камері Горяєва, їх рухливість (бали) – візуально, під мікроскопом. Для вивчення
окисно – відновних процесів у статевих клітинах бугаїв та впливу чинників -
стимуляторів капацитації отриману суспензію клітин, оцінених за рухливістю,
зберігали 6-8 год. при температурі 0 – +4°С з наступним інкубуванням 30, 60 і
120 хв при температурі +38,5°С у середовищах капацитації (табл. 2.2).
Таблиця 2.2
Схама досліду
Умови досліду
Середовища капацитації
Контроль
Фосфатно – сольовий буфер (ФСБ)
Досліди І
ФСБ+гомогенат слизової матки (СМ; яєчник зі "свіжою овуляцією" - на місці
бувшого фолікула утворився згусток крові)
ІІ
ФСБ + фолікулярна рідина (ФР; не інактивована, отримана аспірацією з фолікула
діаметром > 1,5 см, 20% концентрація у пробі )
ІІІ
ФСБ + гепарин (ГП, концентрація у пробі - 200 од/мл)
IV
ФСБ + 0,1% розчин БСА з 150 мМ натрію хлориду
ФСБ + амідопірин (АМП, концентрація у пробі 4Ч10-3М)
VI
ФСБ + перекис водню (Н2О2; 1% -ний розчин)
Досліджували: наявність та стан акросоми сперміїв [399], як маркера
капацитації, інтенсивність поглинання кисню – полярографічно (нг-атом О/0,1мл
СС за хв.); відновну активність – потенціометрично (фериціанід калію – 10-4М;
мкг Кз .../0,1мл СС за хв). Для встановлення впливу середовищ капацитації на
стан окремих ланок дихального ланцюга, їх частку в загальній кількості
спожитого кисню, у проби додавали інгібітори: NaF - 10–3M, амітал - 5Ч10-3М,
NаNз - 5Ч10–2M. Для забезпечення енергетичних потреб сперміїв до середовища
визначення (ФСБ) додавали: фруктозу - 20мМ, піруват, сукцинат, глутамат, a -
кетоглутарат, малат - по 10мМ.
2.3. Вивчення активності глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г-6-ФД) в спермі
Відомо, що спермії, при капацитації, генерують активні форми кисню [122, 275,
494]. Такою ж здатністю володіють статеві клітини із придатка сім’яника, які
здатні утворювати H2O2, кількість якого може збільшуватись в присутності НАДФН
[122]. Забезпечує НАДФН